高效液相色谱分析课件.pptxVIP

高效液相色谱分析;4.1概述;高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。;高压:压力达150-300kg/cm2

高速:分析速度与GC相当

高效:柱效高，N=10000

高灵敏度:10–9~10-11g/ml

操作方便

应用范围广;2.HPLC与GC的比较

分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。

流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。

操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。

;结论：从色谱分析的发展来看，HPLC比GC更为有用、更具发展前途！;3.应用

由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。

下图是各种HPLC方法的应用范围及对象;;4.2液相色谱仪器

highperformanceliquidchromatograph;液相色谱仪（2）;液相色谱仪（3）;液相色谱仪（4）;高压输液装置;

进样系统;

分离系统;

检测系统;

配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置。

;其工作过程如图所示。;;流程图;1.高压输液系统

1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔很约2?m，可防止颗粒物进入泵内。

2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去（气泡会影响检测）。

;3）高压泵：

对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。

输液泵种类：恒压型和恒流型。

;恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。

恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图)。每分钟往复25~100次，因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器)。

;高压输液泵;马达;4）梯度淋洗装置：在分离过程中逐渐改变流动相组成的装置。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量，在高压下混合。

;2.进样系统

与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即，HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。进样装置包括两种。

;1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。

2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。;3.色谱柱

1）对色谱柱的要求：

内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为10~30cm，内径为4~5mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内径更大)；;2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为：

平衡密度法：

使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0。常用的匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；

非平衡密度法：

采用粘度较大的试剂，如CCl4，CH3OH,丙酮，二氧杂环已烷、THF等。;填充方法：

填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)。

;柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。;4.检测器

液相色谱检测器包括紫外吸收、荧光发射、示差折光和安培检测器等。

1）紫外检测器

其检测原理和UV-Vis方法一样。只是此时所采用的吸收池为微量吸收池，通常其