受体的结构与功能.ppt

受体的放射配基结合分析;什么是受体;受体与配基结合的根本特征;受体与配基结合反响的根本原理

----简单单位点系统的根本规律;简单单位点系统质量作用定律;饱和曲线;非特异结合(non-specificbinding，NSB);配基受体结合常数Kd的计算

----Scatchard作图(Scatchardplot);正负协同作用;协同作用的判断

----Hill作图法(Hillplot);以Lg〔[RL]/[RT—RL]〕为纵坐标，Lg[L]为横坐标作图，为一直线，这就是Hill作图。直线的斜率为n，称Hill系数；

简单单位点系统不应有正负协同作用，n=1。

对每一受体结合两个或三个配基的系统，n=2或n=3．

如果n1，那么往往是由于负协同作用或者存在两种亲和力不同的受体亚型，

如果n1但又明显小于2，那么往往是由于正协同作用。;受体与配基反响的动力学(kinetics);竞争性取代反响(competitivedisplacementreaction);另有一类通常称为阻断剂(blockingagent)的物质，它们也能与受体结合，但结合后会引起受体分子不可恢复的结构改变，导致受体功能丧失。当受体与放射配基的结合系统中参加此类物质，就有局部受体被破坏，使受体数量减少，未被破坏的受体那么仍单独与放射配基和受体结合。这类反响叫非竞争性阻断(irreversibleblocking)。

以上两类反响有时统称为抑制结合反响。它们的区别可从Scatchard作图上明显看出;;表示竞争剂抑制作用强弱的指标有二个：IC50值和KI。

IC50值是指抑制50％受体与放射配基结合所需竞争剂的浓度，IC50值大，说明竞争剂抑制作用小。

KI那么是指竞争剂的平衡解离常数，KI越小，说明竞争剂抑制作用越大。

求上述两个参数的实验也有两类：一类是：固定[RT]和[LT]，向系统中加不同量的竞争剂，求得竞争取代曲线。另一类是固定[RT]和[IT](竞争剂浓度)，不断改变[L]，分析[IT]存在时的影响。;;受体放射分析的根本方法;对放射性配基的根本要求;实验目的;用作受体放射分析的放射性配基多用3H、125I标记。

氚标记配基与原型配基为同型式，生物学活性好，多数情况下比活度也能到达要求，且半衰期长，使用方便，主要缺点是需用液闪测量，操作较麻烦，一般实验室不能进行标记。

多肽及蛋白质配基多用125I标记，其优点是可以到达较高的??活度。只要很好掌握标记条件(单碘标记物)，仍能保持较好的生物活性。另外，碘标记法快速、方便、经济，一般实验室可进行。测量操作简单，所以125I配基也大量采用。;;125I—配基比活度的校正;放射性配基的质量鉴定;2，结合活性鉴定

受体结合分析中，放射性配基的活性特别重要，特别是生物活性。目前，测定配基的活性主要是指与受体的结合能力。即测定其最大结合活性：

①以定量标记配基加逐级增加至过量的受体制剂(饱和结合实验)进行反响，测定结合百分率；

②以结合百分率的倒数对受体浓度的倒数作图，获得一条直线；

③延长直线与纵座标的交点，即可算出该标记配基结合活性％。;;受体标本的制备;(二)游离的完整细胞悬液

完整细胞来源分三种：①从组织别离出游离细胞；②血细胞；③培养细胞。

使用完整细胞的优点：

1、受体处于原有的正常环境中。受体与其相连的效应系统(如C蛋白)也保存完好。

2、在受体功能反响完全的情况下研究受体，可以同时观察配基与受体结合的情况和细胞的生物效应。所得的结果更能反映受体的生理特点。

3、能直接给出平均每一个细胞的受体数。

使用完整细胞的缺点：

1、较难控制分析条件，操作可能导致细胞外表生理活性的改变，结果有时不够稳定。

2、细胞上某种受体的含量低时，需加人大量细胞才能获得足够的放射性计数，给实际工作带来一定困难。

3、完整细胞的膜受体在37℃时会产生受体入内化现象(internalization)，导致测定结果不准确，常需要在较低温度下温育。;(三)膜制剂(membranouspreparation)

绝大多数受体结合分析使用膜制剂。

1、使用膜制剂可以减少非特异性结合率。

2、在膜制备过程中，通过洗膜的方法，可以将内源性配基洗去，并除去局部蛋白溶解酶。

3、膜制剂通常也保存有受体—效应器(包括GTP结合蛋白等)结合系统。但受体功能的其他方面那么失去了，膜内离子浓度梯度、受体与细胞结构关系也失去了。但是，受体结合需要的是膜双层脂质结构本身，所以膜碎片内仍保存受体的药理学特性。;细胞膜和细胞浆受体的制备一般采用蔗糖密度梯度离心法。操作流程如下：;为保证所制得的膜受体保持良好的结合活性，需注意：

①全部过程在0℃～4℃下进行操作。

②制备缓冲液的蔗