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植物基因组DNA的提取及定性、定量分析报告--第1页

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《分子生物学》实验报告

实验一植物基因组DNA的提取及其定性、定量分析

[实验目的]

通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分

光光度法对DNA进行定性定量分析。

[实验原理]

CTAB十六烷基三甲基溴化铵是一种阳离子型去污剂,可溶解细胞膜,在高离子强度下

大于0.7MNaCl,与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨,

从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来,再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋

白,最后经乙醇沉淀得到DNA。

琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解

质的多孔支持介质琼脂糖凝胶的样品孔中,并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH

溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子

筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,

因此,在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小

和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系,分子量小的DNA分子比

分子量大的DNA分子迁移速率快,迁移距离远,由此得到分离。凝胶电泳也可以分离相对分子

质量相同,但构型不同的DNA分子,超螺旋质粒DNAcccDNA泳动最快,其次为线状DNAL

DNA,最慢的为开环质粒DNAocDNA。

核酸分子DNA或RNA由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键,在260nm波长处有特异的

紫外吸收峰,其吸收强度与核酸的浓度成正比,这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基

础。1OD相当于dsDNA50μg/mL,ssDNA33μg/mL和ssRNA40μg/mL。可以此来计算核酸

260

样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度,还可通过测定260nm和280nm的紫

外线吸收值的比值A260/A280估计核酸的纯度,若DNA的A260/A280比值高于2.0,则可能有

RNA污染,低于1.8则有蛋白质污染。

[仪器、材料与试剂]

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一、仪器及耗材

离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系

统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器10、100、1000μL

量程各一支、100mL或250mL锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、

1.5mLEP管、PE手套和乳胶手套。

二、药品

三羟甲基氨基甲烷Tris、CTAB十六烷基三甲基溴化铵、β-巯基乙醇、氯仿、苯酚、

乙醇、氯化钠NaCl、盐酸、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸EDTA、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、

核酸染料。

三、试剂

1.2×CTABbuffer[1]

2.70%乙醇[2]

3.RNaseA天根[3]

4.0.5×TBE缓冲液工作浓度[4]

5.6×loadingbuffer[5]

6.核酸染料赛百盛