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红细胞膜流动性测定方法--第1页

悬浮后，红细胞膜蛋白定量，用考马斯亮蓝法三、材料、试

剂与器具

（一）试剂

1、染色液：取考马斯亮蓝G-250（红褐色）100mg溶于

50ml95%乙醇中，加100ml85%磷酸，加水稀释至1升。该

染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。

2、标准蛋白溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白。

3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在10

—30mg/ml

（二）器具

1、试管及试管架

2、移液管（1ml,5ml）

3、可见光分光光度计

四、操作步骤

（一）标准曲线的制作

1、取7支试管，按下表加入试剂

试

管编号0123456

试剂(ml)

1mg/ml牛血清

00.10.20.40.60.81

蛋白

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蒸馏水10.90.80.60.40.20

考马斯亮蓝试

5555555

剂

2、将试管摇匀，放置20分钟。

3、用分光光度计比色测定吸光值A。

595nm

4、以A为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制

595nm

标准曲线。

（二）样品的测定

1、取一支试管，加入未知浓度的蛋白质溶液0.2ml，蒸

馏水0.8ml考马斯亮蓝试剂5ml.

2、将试管摇匀，放置20分钟。

3、比色测定吸光值A，对照标准曲线求得蛋白质的浓

595nm

度。

调整蛋白浓度为200~800ug/ml

荧光偏振法

DPH溶液：将0.464mgDPH溶于1ml四氢呋喃中配制储备液，

浓度为2×10^-3mol/l，剧烈振摇3~5min,f放在棕色瓶中，

避光保存于-20℃冰箱。临用前从冰箱取出，在室温下融化，

每次试验前再用PBS(0.01mmol/l，ph=7.4)）稀释成2×

10^-6mol/l的工作液。稀释时必须猛烈摇晃2~3min,

红细胞膜的荧光标记：将洗净的红细胞与2×10^-6mol/lDPH

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在25℃条件下温育30分钟。加入肝素抗凝的新鲜血液

3000r/min离心5min,加PBS缓冲液,洗涤三次，去除上清在

红细胞沉淀中加入8ml的10mmol/lph=7.4的HCL溶液，同

时加入适量的蛋白酶抑制剂对甲苯磺酰氟，4℃溶血过夜，

使红细胞膜破