常用免疫学关实验技术及的方法(41页).pptVIP

第—笮免疫学方法镢论—、免疫学方法的发展史1976年:Jenner发明了接种牛痘方法预防天花2个世纪后被广泛接受，1979年（WHO）天花灭迹19世纪末期:koch病原体是感染性疾病病因促进了实验免疫学的发展.

19世纪80年代:Pasteur预防鸡霍乱的疫苗狂犬病疫苗1888:Behring发现了抗体Methchnikoff发现了巨噬细胞20世纪初:发现了调理素，体液因素可影响吞噬细胞功能1900-1930:认识了过敏反应，发现了血清病Arthus反应，皮肤反应调理作用，补体结合反应疫苗研宄有了新发展:BCG——结核白喉毒素一白喉

1935-1957:抗体纯化，鉴定及测定技术、凝胶内沉淀技术，抗原抗体、免疫电泳等血清血技术1959-1974；放射标记免疫技术、酶标免疫技术、生物素?亲和素标记免疫技术、荧光标记免疫技术、金（银）标记免疫等技木:化学发光免疫技术、免疫分子转染技术、细胞和细胞因子测定技术

第二笮体液免疫学方法一、抗原制备1.天然抗原制备⑴粗抗原的提取:冻融法、冷热交替法、超声法(1-2HE)(2)粗抗原纯化:?选择性沉淀法:盐析沉淀法、核酸沉淀法?凝胶过滤和离子交换层析?亲和层析法?蛋白电泳

二、抗体制备1?多克隆抗体制备(polyclonalantibody)多克隆抗体是指在自然免疫或免疫动物后产生的具有不同特异性和亲和性的多种抗体混合分子。具有抗多种不同抗原的表位。

2.单克隆抗体制备(monoclonalantibody)单克隆抗体是指由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体。产生方法:B细胞克隆与小鼠骨髓瘤细胞融合产生的杂交瘤细胞

3.基因工程抗体(engineerantibody)应用抗体库技术产生方法:将某种动物所有抗体的可变区基因克隆到质粒或噬菌体中并表达，然后利用不同抗原筛选出携带特异抗体的基因克隆，从而获得特异性抗体。

三、抗体的应用及其相应的免疫学技术（一）eLisaELISA的基本原理是利用酶标记抗体或抗原,使之成为酶标抗体（或抗原）,这种酶标抗体或抗原既保留其免疫原性,又保留酶的活性；中外,使抗原或抗体固定到某种固相载体表面并保持其免疫活性,利用抗原、抗体复合物的免疫学反就原理来测定未记标的抗原（或抗体）。具体操作时是把受检标本（检测其中的抗体或抗原）和酶标抗原蔌抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应,经洗涤后使固相载体上形成的抗原、抗体复合物与其他物质分开,最后结合到固相载体上的酶量与标本中的受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,其量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据反应颜色的深浅来进行定性或定量分析,

｛二)放射免疫测定(radioimmunoassay)放射免疫测定通常用于测定组织液和血液中的激素水平。放射免疫分析多数用125i来标记抗体。被检测抗原即未标记物,通常吸附在固相载体中,如多孔酶联塑料板或试管中,在此固相载体中标记的特异性抗体与特定的未标记抗原产生特异性免疫结合。非特异性吸附可以通过加入过量的非特异性卵磷脂蛋白或洗涤液来封闭,未结合的标记抗体则用洗液去除。最终特异性结合的抗原、抗体复合物残留在反应板或试管中,用125l标记的抗体,其放射性强度可以直接测定?

《三）免疫荧光技术（immunofluorescencetechnology）免疫荧光技术的原理是将荧光色素与特异性抗体（或抗原,但少用）以化学的方式结合起来,但不影响该血清抗体的免疫特性。而后将荧光标记了的抗体作为一个试剂,在特定的条件下浸染标本,使之与标本中相应的抗原产生结合反应,这个反应的结果——含有荧光标记的抗原、抗体结合物,可用荧光显微镜来观察之。

《四）免疫组织化学技术（immunolhistochemistry）检测组织切片中蛋白分子在细胞中分布的另一种方法（类似于免疫荧光技术＞为免疫组织化学技术。该方法是用化学的方法将酶与抗体结合起来（类似于ELISA）,然后将标记的抗体与组织切片中的抗原产生特异性的结合。结合后的抗原、抗体复合物中含有的酶可将再加入的无色酶底物通过化学反应呈色,最终借助显微镜在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质及其分析。

｛五）免疫印迹技术（immunoblot）免疫印迹技术也称Westernblot或蛋白印迹技术（proteinblot）,是20世纪70年代末80年代初发展起来的一种蛋白质抗原检测新技术其基本过程是将蛋白质样品（如血清或细胞组织碎片）在凝胶电泳中分离,再通过电转染将己分离的蛋白南分子转移到固相膜上,然后在固相膜上用标记（放射标记或酶标记）