TCVMA-鸡球虫种类ITS1-PCR鉴定技术.pdf

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团体标准

T/CVMAXXXXX—XXXX

鸡球虫种类ITS1-PCR鉴定技术

ITS1-PCRidentificationtechniqueofchickencoccidiaspecies

征求意见稿

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

中国兽医协会发布

T/CVMAXXXXX—XXXX

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起

草。

本文件由中国兽医协会兽医寄生虫病防治分会提出。

本文件由中国兽医协会归口。

本文件起草单位：

本文件主要起草人：

1

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鸡球虫种类ITS1-PCR鉴定技术

1范围

本文件规范了公认的7种鸡球虫种类ITS1-PCR鉴定技术。

本文件适用于鸡球虫病的临床诊断、防控监测、流行病学调查、疫苗生产及鸡球虫相关科研工作等。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682-2008,分析实验室用水规格和试验方法.

3术语与定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4符号与缩略词

下列符号和缩略语适用于本文件。

PCR：聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction）

ITS：内转录间隔区（InternalTranscribedSpacer）

DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）

TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸（Tris-acetate-EDTA）

bp：碱基对（Basepair）

5仪器设备和主要试剂

5.1仪器

PCR仪、4℃高速低温离心机、电泳槽，微量移液器、凝胶成像系统

5.2主要试剂

异硫氰酸胍、苯酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、70%酒精DNAMarkerDL-2000、2×TaqDNA聚合

3

酶Mix、琼脂糖、饱和食盐水（1000ml沸水中加入食盐380g，比重约1.18g/cm）

6操作步骤

6.1卵囊DNA的提取

取2000个左右待检鸡球虫孢子化卵囊置于2mL离心管中，加入直径为1mm的玻璃微珠0.2g,加入

600µL5mol/L异硫氰酸胍，涡旋振荡5min，显微镜下观察卵囊壁破碎情况，当大部分卵囊壁被破碎后，

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将其置于37℃水浴摇床上作用30min；加入等体积的饱和酚溶液600µL，振荡混匀20s,12000g离心5

min；将上清液转移至另外一个2mL离心管中，向离心管中加入等量的苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：

1）的混合溶液，振荡混匀20s，12000g离心5min，取上清液；向上清液中再加入等量的氯仿：异戊醇

（24