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第八章发酵工程技术概论

第一节概述一、发酵工程（fermentationengineering）又称微生物工程：p通过微生物完整的细胞自催化完成生物化学反应过程，微生物既能正常生长又能过量积累目的产物，提供工业产品。p包括：抗生素，氨基酸，维生素，有机酸，酶制剂，蛋白质，基因工程药物，核酸类等。

二、发酵工程发展的4个阶段（1）厌氧发酵的生产过程：如酒精，乳酸等。（2）好氧（通气）发酵的生产过程：如抗生素、氨基酸、酶制剂等。v第一阶段：天然发酵阶段：传统的酿酒、制酱等。1675年荷兰人列文虎克发明了显微镜。法国巴斯德在1857～1876持续研究发酵作用。v第二阶段：1900～1940人工控制微生物发酵过程（纯培养阶段），新产品酵母，甘油，乳酸，柠檬酸，丙酮和丁醇（第一个工业发酵产品）v第三阶段：通气搅拌技术阶段（深层通气培养法），1942年青霉素工业化生产，1944年链霉素。v第四阶段：利用基因工程菌进行发酵阶段。

三、发酵工程的研究内容v生产菌种的培养和选育（菌种）v培养基制备（培养基）v发酵条件的优化与控制（搅拌通气，溶氧，发酵过程参数控制，反应器的设计）v产物的分离、提取与精制等（纯化）v菌种工艺设备

第二节优良菌种的选育一、菌种选育的物质基础：DNA二、自然选育(spontaneousmutation)：自发突变（正负）三、诱变育种：人工诱变四、原生质体融合：基因重组

三、诱变育种（一）方法和原理1.诱变机制（1）微小损伤突变：碱基置换，码组移动（2）染色体畸变：易位，逆位，缺失，重复（3）染色体组突变：数目变化（单倍体变多倍体）2.诱变剂及其作用方式：物理诱变剂，化学诱变剂，生物诱变剂常用诱变剂p-263

（二）诱变和筛选初步筛选是关键步骤1.自身耐药突变株：耐受自身分泌的抗生素，提高产量2.结构类似物或前体类似物的耐受突变株：解除反馈抑制3.营养缺陷型及其回复突变株

3.营养缺陷型及其回复突变株v通过诱变导致某些基因的突变，而需要添加一些物质（氨基酸、核苷酸等）才能生长的突变体。营养缺陷型的作用：v解除末端产物的反馈调节作用。v作为标记，在杂交育种中作为出发菌株有利于杂交重组的分析。v作为基因工程的受体菌，检出克隆基因的表达。

v诱变包括：出发菌株的选择诱变剂种类和诱变剂剂量的选择合理的使用方法v筛选包括：初筛重复筛选突变株性能检测直到获得新的优良菌株。

四、原生质体融合v原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。1.一般程序2.影响融合的因素：v菌龄，培养基成分，PEG,外界因素（高渗溶液，酵母膏）3.原生质体融合育种：真菌（蘑菇），细菌，植物（马铃薯、草莓、胡萝卜、烟草、矮牵牛、拟南芥、油菜、玉米、水稻、豌豆、甘蔗、柑桔、猕猴桃等）

原生质体融合v目前最成功且至今广为使用的是以PEG作为融合剂，对于所有种类的真菌而言，PEG诱导融合剂条件基本一致：(1)原生质尽可能的幼嫩；(2)原生质体要纯；(3)最适的高渗稳定剂；(4)用于融合的两菌株原生质体的浓度一般为107，两菌株总量为1∶1；(5)PEG分子量为4000～6000，浓度为25％～40％，(6)pH7～9在Ca2+存在下融合率可进一步提高。

融合子的检出v原生质体融合后，如何筛选融合子，是原生质体技术应用的关键。其方法有：v营养缺陷型互补选择v抗药性选择v灭活原生质体v荧光染色v分子标记选择v还可借助形态标记，自然生态标记等来初判异源融合子。

第三节发酵的基本过程一、菌种：0～4℃休眠保存，砂土管1～2年二、种子的制备：摇瓶种子罐扩大生产三、发酵：培养基，发酵罐参数四、发酵液预处理五、提取精制

发酵罐参数v温度26～37℃，压力0.3～0.5kg/cm2，搅拌速度，通气量0.3～1m3/m，接种量5%～20%，pH，培养基体积、粘度、泡3沫情况、菌丝形态、溶氧浓度、CO含量、总糖、氮、磷、2产物含量等。v发酵周期一般2～8d

第四节发酵方式*一、分批(间歇)发酵：物料一次投入反应器中，灭菌、接种、发酵。v特点：一次性；发酵过程中，营养不断减少，微生物不断增殖，环境非稳态；微生物生长的四个时期明显；应用广泛，改善（在线检测，计算机控制）。二、补料分批发酵：补加新鲜培养基。v特点：可以解除底物抑制、产物抑制或克服微生物过度生长；提高有用产物的转化率；应用广泛，用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工业；

三、连续发酵：恒化器（基质恒）、恒浊器（菌体密度恒），连续进料出料平衡，保持恒定的发酵液密度。易实现自动化生产，如啤酒，乙醇的发酵。v优点：操作稳定；利于机械、自动化；提高设备的利用率；减少灭菌次数