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分子克隆

报告人：*克隆载体PCR技术DNA操作酶DNA重组技术C

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s*分子克隆分子克隆（基因克隆、DNA重组技术）通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。分子克隆的核心是:体外重组即人工将一段目的DNA插入一个载体的过程*载体DNA（vector）目的DNA（targetfragment）重组DNA（recombinantDNA）宿主（host）筛选、扩增克隆（clone）分子克隆的路线DNA重组转化*载体的特性1分子较小,可携带比较大的DNA片段载体的特性能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制2有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达,并且尽可能是高效的表达43要有尽可能多种限制酶的切割位点,但每一种限制酶又要最少的切割位点5从安全角度考虑,要求载体不能随便转移,仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制有适合的标记,易于选择6*1234质粒载体噬菌体载体酵母菌质粒载体动植物病毒载体克隆载体*质粒载体质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA,一般大小约为数千碱基对,可自身复制和表达,有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因,所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体*噬菌体载体一种典型的头-尾结构,双链线状DNA分子,全长50kb,含66个基因,在其分子两端各含有12个碱基的互补单链,是天然的粘性末端,被称为COS位点λ噬菌体一种典型的纤维状结构,其DNA分子相比λ噬菌体要小的多,长度仅6407个核苷酸,通常为环状双链DNAM13噬菌体*λ噬菌体结构它本身是一种核蛋白,核心是一段DNA,结构上有一个蛋白质外壳和尾巴,尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内*cos位点的作用cos位点在λ噬菌体侵染周期中起着两种截然不同的作用使已经注入细胞的线性DNA分子闭合成环，这是使噬菌体DNA分子插入细菌基因组的必要先决条件当前噬菌体被从宿主细胞中切除后,此时其作为一个限制性内切核酸酶的识别序列*λ噬菌体的侵染模式*M13噬菌体的侵染过程M13以纤毛吸附大肠杆菌,并向其注入自身DNA单链DNA注入宿主细胞后,合成第二条链(双链复制模式RF)RFDNA拷贝数达到100～200个后,通过滚环复制机制产生线状单链DNA包装成为成熟的噬菌体颗粒并从细菌体内溢出。*PCR的基本反应步骤变性95?C延伸70-75?C退火Tm-5?C*第一次循环第二次循环72℃94℃94℃TaqDNApol.P1P2（35-65℃）*PCR技术最关键的两步引物的设计引物必须相应于模板分子相邻的序列,引物序列于对应的模板连应该是互补而不是相同的,这样杂交才会发生且杂交后的引物的3‘末端应该对着另一条引物的3’末端。最重要的是引物的长度,因为引物的长度影响其杂交到模板DNA上去的效率,引物越长杂交所需的时间越长；引物太短可能与目标位点以外的位点相杂交,而扩增出我们并不需要的产物*退火温度温度太高,不会有杂交发生引物与模板仍然相互分离；温度太低,又会有稳定的错误配对发生。退火温度有引物-模板杂交结构的解链温度(Tm)决定,Tm是指正确的碱基配对杂交结构相互分开的温度Tm={(4*[G+C])+(2*[A+T])}?C*DNA操作酶A限制性内切酶BT4DNA连接酶CTaqDNA聚合酶D逆转录酶是一类由细菌产生的能专一识别和切割双链DNA中的特定碱基序列的核酸内切酶,简称限制酶或切割酶。根据限制酶作用特性,一般分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型,其中常用的是Ⅱ型限制酶催化双链DNA中一条链的3ˊ－OH与另一条链的5ˊ－PO3H2形成磷酸二酯键,从而构成完整的DNA长链逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶活性:⑴以单链RNA为模板，催化合成cDNA单链⑵具有RNaseH活性，能水解RNA:DNA杂交链中的RNA⑶以DNA为模板，催化合成cDNA双链TaqDNA聚合酶是一种依赖DNA的单亚基耐热DNA聚合酶,主要用于聚合酶链式反应中,能以DNA为模板,从结合在模板上的引物出发,以dNTP为原料,按碱基配对方式