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羊副流感3型诊断技术规范

1范围

本文件规定了绵羊、山羊副流感3型的临床症状、病原分离、RT-PCR、ELISA方法的实验室诊断技术要求。

本文件适用羊饲养场（户）和动物疫病诊疗单位对羊副流感3型病毒的检测。

2规范性引用文件

下列文件中内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

3术语与定义

下列术语与定义适用于本文件。3.1

羊副流感病毒3型CaprineParainfluenzavirustype3，CPIV3

属于副黏病毒科，呼吸道病毒属成员，为有囊膜的单股负链RNA病毒。该病毒可引起以羊发热、呼吸困难、流浆液性或黏脓性鼻液和咳嗽等呼吸道症状为特征的疾病。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）

TAE缓冲液：是由三羟甲基氨基甲烷(TrisBase)、乙酸(AceticAcid)和乙二胺四乙酸(EDTA)组成的缓冲液

FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）

PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSolution）

5临床症状

病羊主要临床症状包括：流清亮或黏脓性鼻液、咳嗽气喘、体温升高到40℃以上、精神沉郁、食欲减退、部分羊可见流泪、结膜炎、流涎、有时出现腹泻。

6实验室诊断

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6.1病毒分离方法

6.1.1材料

棉签、FBS、DMEM培养基、青霉素、链霉素、细胞培养瓶（板）。

6.1.2仪器

电子天平、研磨仪、低温高速离心机、生物安全柜、CO2培养箱、倒置显微镜、冰箱。

6.1.3细胞

牛肾细胞（MDBK）。

6.1.4病料采集

6.1.4.1呼吸道拭子用无菌棉签采取鼻道分泌物，然后放入含1000IU/ml青霉素1000μg/ml链霉

素的DMEM培养基的冻存管中，编号，记录，2℃~8℃条件下，尽快送往实验室。

6.1.4.2粪便拭子用无菌棉签插入肛门取样或用棉签采集新鲜粪便，然后放入含1000IU/ml青霉素

1000μg/ml链霉素的DMEM培养基中，编号，记录，2℃~8℃条件下尽快送往实验室。

6.1.4.3血清样品用促凝管采集新鲜血液，静置分离血清，编号，记录，2℃~8℃条件下尽快送往

实验室。

6.1.4.4组织样品刚死亡的羊，采集肺组织样品，放入离心管，编号，记录，2℃~8℃条件下尽快

送往实验室。

6.1.5样品处理

6.1.5.1先经冻融两次，拧干棉拭子，将样品液经6000r/min离心10min，使用一次性注射器吸取

上清经0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃以下保存备用。

6.1.5.2血清将促凝管中静置分层的血清转移到灭菌离心管，-20℃以下保存备用。

6.1.5.3组织按体积比1:3～1:5加入PBS（pH7.2～7.4），使用组织研磨仪制成匀浆液，取悬液经

0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃以下保存备用。

6.1.6样品接种

取处理过的样品200μl（样品接种量根据细胞数目调整）接种到长满80%的MDBK细胞（25㎝2培养瓶），37℃吸附30min；加入含2%FBS的细胞培养液5ml，同时设对照组，置于37℃,5%CO2的培养箱。

6.1.7结果判定

逐日观察细胞病变，培养5日后冻融两次，继续盲传，观察细胞病变。CPIV3致细胞病变特点：细胞变圆、大量脱落、贴壁细胞变长聚集形成网状。盲传三代后，若出现病变则收获培养物，经反复冻融，以3000r/min离心10min，去除细胞碎片并取上清液进一步鉴定。

6.2RT-PCR

6.2.1材料

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移液器及吸头、无菌无酶离心管、PCR管、病毒RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂盒、TAE缓冲液、琼脂糖、核酸染料、引物（附录A）

6.2.2仪器

PCR仪、台式冷冻离心机、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪。

6.2.3待检样品

处理后的样品或细胞培养物。

6.2.4病毒RNA提取

使用病毒RNA提取试剂盒对已处理的待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品进行RNA提取并使用核酸分析仪对RNA质量及浓度进行测定。

6.2.5RT-PCR反应体系

6.2.5.1RT反应

20μl体系：下游引物1μl