2024年生物信息学复习笔记.docx

生物信息学

12月21曰

14:33

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填空，选择，计算，简答，名詞解释

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几代测序的代表平台，优缺陷

一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法

Sanger法关键原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标识的ddNTP（分為：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列

第一代测序技术的重要特点是测序读長可达1000bp，精确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺陷，严重影响了其真正大规模的应用

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以Roche企业的454技术、illumina企业的Solexa，Hiseq技术和ABI企业的Solid技术為标识的第二代测序技术诞生了

?（1）DNA待测文库构建

运用超声波把待测的DNA样本打断成小片段，目前除了组装之外和某些其他的特殊规定之外，重要是打断成200-500bp長的序列片段，并在这些小片段的两端添加上不一样的接头，构建出单链DNA文库。

????（2）Flowcell

Flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，当文库建好后，这些文库中的DNA在通过flowcell的時候会随机附着在flowcell表面的channel上。每个Flowcell有8个channel，每个channel的表面都附有诸多接头，这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头互相配对（这就是為何flowcell能吸附建库后的DNA的原因），并能支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩增。

????（3）桥式PCR扩增与变性

桥式PCR以Flowcell表面所固定的接头為模板，进行桥形扩增，如图4.a所示。通过不停的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，每一种束都具有单个DNA模板的诸多分拷贝，进行这一过程的目的在于实現将碱基的信号强度放大，以到达测序所需的信号规定。?

（4）测序

测序措施采用边合成边测序的措施。向反应体系中同步添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标识的4中dNTP（如同Sanger测序法）。这些dNTP的3’-OH被化学措施所保护，因而每次只能添加一种dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完毕荧光信号的记录，最终运用计算机分析将光学信号转化為测序碱基。这样荧光信号记录完毕后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并清除dNTP3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。Illumina的这种测序技术每次只添加一种dNTP的特点可以很好的地处理同聚物長度的精确测量问題，它的重要测序錯误来源是碱基的替代，目前它的测序錯误率在1%-1.5%之间，测序周期以人类基因组重测序為例，30x测序深度大概為1周。

第二代测序技术大大减少了测序成本的同步，还大幅提高了测序速度，并且保持了高精确性

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以PacBio企业的SMRT和OxfordNanoporeTechnologies纳米孔单分子测序技术，被称之為第三代测序技术。

其中PacBioSMRT技术其实也应用了边合成边测序的思想5，并以SMRT芯片為测序载体。基本原理是：DNA聚合酶和模板結合,4色荧光标识4种碱基（既是dNTP）,在碱基配对阶段,不一样碱基的加入,会发出不一样光,根据光的波長与峰值可判断进入的碱基类型。同步这个DNA聚合酶是实現超長读長的关键之一,读長重要跟酶的活性保持有关,它重要受激光对其导致的损伤所影响。PacBioSMRT技术的一种关键是怎样将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景区别出来。他們运用的是ZMW（零模波导孔）原理：如同微波炉壁上可看到的诸多密集小孔。小孔直径有讲究,假如直径不小于微波波長,能量就会在衍射效应的作用下穿透面板而泄露出来，从而与周围小孔互相干扰。假如孔径不不小于波長,能量不会辐射到周围，而是保持直线状态（光衍射的原理）,从而可起保护作用。同理,在一种反应管(SMRTCell:单分子实時反应孔)中有許多这样的圆形纳米小孔,既ZMW(零模波导孔),外径100多纳米,比检测激光波長小(数百纳米),激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区,能量被限制在一种小范围(体积20X10-21L)里,恰好足够覆盖需要检测的部分,使得信号仅来自这个小反应区域,孔外过多游离核苷酸单体仍然留在黑暗中,从而实現将背景降到最低。此外，可以通过检测相邻两个碱基之间的测序時间，来检测某些碱基修饰状况，既