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斑马鱼原位杂交实验方案--第1页
表观遗传学与表观基因组学
斑马鱼全胚胎原位杂交技术
FormDr.Kevin
第一节原位杂交技术的历史
JosephG.Gall被誉为现代细胞生物学的一位奠基人，他在染色体结构和功能领域作出了杰出贡
献，并发明了原位杂交技术（insituhybridization，ISH）。自Gall同他的研究生MaryLouPaudue和
SusanGerbi在1969年利用放射性标记DNA在爪蟾组织切片中检测基因表达后，原位杂交技术逐渐发
展为一种能使研究人员在一个染色体上定位并确定出基因和特殊的DNA序列的强大方法，推动了分子生
物学的巨大进步。
KathleenH.Cox于1984年发明了用单链RNA探针进行原位杂交的技术。ISH技术在斑马鱼中的
应用始于Westerfield等利用该技术在斑马鱼切片中检测基因的表达。同年,Nusslein-Volhard等将Cox
建立的RNA原位杂交技术进行了改进,用地高辛（digoxin）标记的RNA在斑马鱼胚胎中检测基因表
达。2008年,BernardThisse等将该技术进一步优化,使之更敏感,也提高了基因表达检测的分辨率，我
们在这里介绍的整胚原位杂交技术主要参照Thisse实验室2008年版本（Thisse,C.andThisse,B.,
2008,Highresolutioninsituhybridizationonwhole-mountzebrafishembryo.Nat.protoc.3:59–
69）。
第二节原位杂交技术的原理
原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于
那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从
组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更
能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。
整胚原位杂交（whole-mountinsituhybridization）不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探
针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部
位。整胚原位杂交指在胚胎组织或细胞结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核
酸杂交中碱基配对原则，与待测组织中相应的基因片段相结合（杂交），所形成的杂交体(Hybrids）经
显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。该技术不仅
可以用于检测基因的时空表达,为研究该基因功能以及基因分类提供线索，还可以应用于高通量药物筛选
或突变体筛选中,以特异表达的基因标记作为筛选的重要依据。（图5.1）
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斑马鱼原位杂交实验方案--第1页
斑马鱼原位杂交实验方案--第2页
表观遗传学与表观基因组学
图5.1斑马鱼整胚原位杂交技术原理。地高辛标记的反义RNA探针与细胞内的mRNA特异性结合,利
用免疫组织化学的方法,碱性磷酸酶结合的抗地高辛抗体与杂交的核酸探针特异性结合,然后用碱性磷酸
酶的发光底物进行显色。图
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