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DNA序列测定：其他测序技术

随着新理论、新技术的不断涌现，出现了多种原理完全不同的测

序方法，为DNA分子的序列分析提供了新的选择。

一、杂交测序法

杂交测序法（sequencingbyhybridization，SBH）是一种原理

完全不同的测序新技术。其基本原理是：如果一段较短的DNA探针能

够同较长的靶DNA分子杂交并完全互补，便可以据此推断在靶DNA分

子上存在着该DNA探针相应的互补序列。因此，使用序列已知、长度

特异、具有所有可能的碱基序列的寡核苷酸群体（即杂交探针），与

未知序列的待测DNA片段进行分子杂交，然后对于能同靶DNA分子完

全杂交互补的探针之间的碱基重叠关系进行比较和分析，据此推知待

测DNA的碱基序列。

在方法学上，SBH有两种方式：一种是将目的DNA固定于载体上，

然后用一套探针逐一杂交，需大量操作步骤；另一种以点阵的方式将

探针固定于载体表面，每点探针序列已知，然后目的DNA与其点阵杂

交，只需一次操作。显然，只有后一种方式切合实际。

现在，DNA杂交测序的操作方式主要通过寡核苷酸测序芯片

（sequencingchip）来实现。芯片测序系统本身在探针合成、探针

点阵、核酸标记及信号检测等方面都有了重大的改进和发展。作为一

种快速化、微型化、自动化的测序方法，SBH有望在未来大规模测序

和基因诊断中发挥重要作用。

但杂交测序法不适用于简单重复序列、poly（A）尾及卫星DNA

的直接测序，难以克服核酸二级、三级结构对杂交的干扰影响，限制

了其应用范围。并且，其广泛应用尚需进一步提高杂交信号的稳定性，

减少因单碱基错配造成的假阳性率以及降低检测成本等。

二、焦磷酸测序技术

自Nyrén于1987年首先通过生物荧光实现对DNA聚合过程的监

测以来，Hyman于1988年创立了相应的测序技术，但实际应用不佳。

现今的焦磷酸测序技术（pyrosequencing）是由Ronaghi等人于1998

年建立的。

Pyrosequencing是一种新型的酶级联反应测序技术，是由4种

酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。其基本原理是：测

序引物与单链DNA模板退火后，通过DNA聚合酶、ATP硫酸化酶（ATP

sulfurylase）、荧光素酶（luciferase）和三磷酸腺苷双磷酸酶

（apyrase）等4种酶的级联反应，将每一个dNTP的掺入与一次荧光

信号的释放偶联起来，以荧光信号的形式实时记录DNA模板的核苷酸

序列。在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配

对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基

团（PPi）。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为

一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后

加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。

其酶促级联反应如下：

Pyrosequencing反应步骤如下：

第1步：1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入

酶混合物和底物混合物。酶混合物包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、

荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶等4种酶，底物混合物包括腺苷-5′

-磷酸硫酸酐（adenosine5′phosphosulfate，APS）和D-荧光素

（D-luciferin）。

第2步：向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模

板下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的

3′末端，同时释放出一个分子的焦磷酸（PPi）（图-1）。

图-1焦磷酸测序法第二步

第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合

形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可和荧光素结合形成

氧化荧光素，同时产生荧光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的

检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比（图-2）。

图-2焦磷酸测序法第三步

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