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免疫组化（Immunohistochemistry）技术常见问题及其解答集锦-2

10、内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度是什么？

（1）一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右；而0。3%过氧化

氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min。

（2）用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组

织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片。

（3）现用现配，配好后4度避光保存。

11、如何才能充分脱蜡？

（1）蜡不溶于水，如果脱蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起

染色不均匀、阳性物时隐时现、真假难辨、背景染色增加等。为了解

决上述的问题，切片在染色前必须彻底脱蜡，目前用于脱蜡的试剂主

要是二甲苯，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短；

（2）脱蜡的时间要根据季节，室温和试剂的新鲜谋面是在不同。如果

在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟

就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间

需要延长，10-20分钟或更长。

（3）当天切的切片，烧烤2小时后进行染色，切片带有温度进行脱蜡

这将可加速脱蜡的过程，如果预先切好烤好的切片，在染色前，还必

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须对切片进行加温10-20分钟，然后再行脱蜡，这样脱蜡速度加快，

效果魁伟更好。

总之，操作时应根据不同的季节，不同的室温，不同的试剂来决定，

脱蜡的时间，原则上是要彻底、干净、完全地脱去切片上的蜡。

12、如何最大限度地降低组织非特异性染色？

（1）缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。

（2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看

看。

（3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血

细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背

景染色；

（4）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫

血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；

（5）缩短DAB孵育时间或降低DAB浓度/过氧化氢浓度等；

（6）适当增加PBS冲洗次数和浸洗时间，在一抗、二抗或SP孵育之后

的浸洗尤为重要；

（7）防止标本染色过程中出现干片，这容易增强非特异性着色。

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13、苏木素复染时间的把握？

（1）苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位

等情况，一般数秒-数分钟。不过这个如果染色不理想可以补救的。即：

染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。

（2）盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振

洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在

放入氨水中返兰即可。

（3）如果分化的颜色过浅，可以复置于苏木素中染色。

14、PBS的清洗方式选择、次数和时间的选择？

（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。

临床上每天检测的病例很多，所用的抗体种类及项目也多，如果在加

入一抗孵育完后，将它们在一个缸内洗，这样就会造成交叉污染，影

响最后的结果。正确的做法是单独地进行冲洗，冲洗的PBS为一次性，

保证切片没有相互交叉污染的机会。