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PKM2对谷氨酰胺代谢和线粒体损伤的调控机制及白藜芦醇的干

预作用

为应对缺氧和低营养条件的肿瘤微环境,肿瘤细胞往往发生能量代谢的改变,

即“代谢重编程”。主要表现在两个方面:有氧糖酵解和对谷氨酰胺的高度依赖。

肿瘤细胞通过代谢重塑为其生物合成提供大量的中间代谢产物,表明代谢重

编程在肿瘤恶性转化过程中举足轻重的作用。肿瘤细胞的葡萄糖代谢和谷氨酰胺

代谢途径均受到复杂的信号转导途径的调控,因此探讨这两种代谢途径间的调控

关系及其产生原因,将为以肿瘤代谢为靶点的肿瘤治疗提供理论基础。

近年来,随着人们对肿瘤细胞能量代谢重塑的深入研究,发现M2型丙酮酸激

酶(M2typepyruvatekinase,PKM2)在糖酵解过程中扮演着关键角色。PKM2是

糖酵解途径中将磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转化成为丙酮酸和ATP的限速酶。

已知PKM2在肿瘤细胞中特异性高表达,在协调肿瘤细胞葡萄糖相关代谢途

径(包括糖酵解、磷酸戊糖和丝氨酸合成途径)中发挥关键作用,但PKM2是否参与

谷氨酰胺代谢及线粒体功能调控却鲜为人知。本研究探讨了PKM2与谷氨酰胺代

谢及线粒体功能调控之间的关系,并对其分子机制进行深入研究,为以代谢为靶

点的肿瘤治疗提供新思路;进一步以PKM2作为肿瘤治疗的靶点,探讨了白藜芦醇

对PKM2的干预作用及分子机制,同时拓展了白藜芦醇的药用价值。

本研究获得的主要研究结果如下:(1)探讨PKM2与谷氨酰胺代谢之间的关系

及其分子机制。研究结果表明,PKM2稳定敲低能够增加谷氨酰胺酶Gls1、Gls2,

谷氨酰胺转运受体SLC1A5及其上游转录因子β-catenin、c-Myc的表达,而PKM2

过表达可抑制其表达,表明β-catenin/c-Myc信号通路介导PKM2对谷氨酰胺代

谢的调控。

放线菌素D实验显示,PKM2上调β-catenin的表达主要是通过调控其转录水

平,而不是通过抑制mRNA降解。检测PKM2不同点突变细胞株中β-catenin的表

达,发现R399E突变细胞能明显抑制β-catenin的表达,即二聚体形式的PKM2发

挥关键作用。

PKM2过表达上调miR-200a的表达,miR-200a可与β-catenin的3’UTR结

合抑制β-catenin的表达。(2)探讨PKM2与线粒体功能之间的关系。

采用线粒体探针标记PKM2过表达及敲低的细胞中的线粒体,显微镜观察发

现PKM2过表达的细胞中线粒体围绕细胞核分布,融合线粒体的比例升高,线粒体

数量减少。而PKM2敲低后,线粒体分裂为更小的单位,数量增多。

qPCR和westernblot结果显示PKM2过表达后,线粒体分裂蛋白Drp1表达

减少,融合蛋白Mfn2表达升高;PKM2敲低后,Drp1表达升高,Mfn2表达降低;同

时,PKM2过表达导致ATP生成量减少,线粒体DNA拷贝数增加,电子传递链复合物

的表达下降。(3)探讨PKM2通过Drp1调控线粒体动态平衡的分子机制。

研究结果显示PKM2过表达能够在蛋白水平抑制p53表达,PKM2敲低促进其

表达,而对p53mRNA水平没有影响。采用p53siRNA处理细胞后,Drp1随p53表

达的下降而下降,表明PKM2能够通过p53调控Drp1的表达。

蛋白稳定性实验提示,PKM2过表达促进了p53通过蛋白酶体途径降解,而

PKM2敲低可增加p53蛋白的稳定性,该过程是通过MDM2介导的p53泛素化实现

的。免疫共沉淀及GSTpull-down实验表明,PKM2与p53、MDM2存在相互作用,

推测PKM2与MDM2可结合到p53不同的结构域形成三元复合物促进p53的泛素化,

进而通过蛋白酶体途径被降解。

免疫组化检测宫颈癌病人临床样本中PKM2和Drp1的表达,结果显示PKM2

与Drp1的表达呈负相关,这与细胞水平得到的结果是一致的。(4)探讨PKM2通过

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