DB64T1682-2019 包装饮用水中铜绿假单胞菌的快速检测方法.pdf

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DB64

宁夏回族自治区地方标准

DB64/T1682-2019

包装饮用水中

铜绿假单胞菌的快速检测方法

2019-12-18发布2020-03-17实施

宁夏回族自治区市场监督管理厅发布

0864/T1682-2019

刚吕

本标准是按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。

本标准由宁夏回族自治区食品检测研究院提出。

本标准由宁夏回族自治区市场监督管理厅归口并组织实施。

本标准起草单位：宁夏回族自治区食品检测研究院、宁夏回族自治区食品药品审评查验中心。

本标准主要起草人：邓军、高俊峰、夏莉娟、冯秀娟、赵艳、李雯、董川｜。

DB64/T1682一一2019

包装饮用水中铜绿假单胞菌的快速检测方法

1范围

本标准规定了包装饮用水、饮用天然矿泉水中铜绿假单胞菌检测的环介导恒温核酸扩增CLAMP)

的方法。

本标准适用于包装饮用水、饮用天然矿泉水中铜绿假单胞菌的定性检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单〉适用于本文件。

GB8538-2016食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3缩略语

DNA(deoxyribonuclelcadd）：脱氧核糖核酸。

dNTP(deoxyribonucleosidetriphosphate）：脱氧核昔三磷酸。

LAMP(loop-mediatedisothennalamplification）：环介导恒温扩增。

OprL：编码OprL蛋白（肤聚糖相关外膜脂蛋白）的基因。

TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基隧。

4生物安全措施

按照GB19489中的有关规定执行。

5防污染措施

防止污染措施应符合GB/T27403的规定。

6原理

根据铜绿假单胞菌特异OprL基因序列（参见附录A）设计的两对特殊的内、外引物及一对环状引

物，特异性识别靶序列上的六个独立区域，利用EstDNA聚合酶启动循环链置换反应。EstDNA聚合

酶具有强链置换能力，能在63℃这一恒温条件下实现对目标基因的扩增，在铜绿假单胞菌OprL特异基

因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成很多类似花椰菜结构的茎环DNA混合物。

0864/T1682一－2019

当发生扩增反应时，反应体系中添加的染色剂（SYBRGreenI）能以嵌入方式结合到扩增出来的DNA

混合物小沟处，随着双链DNA的增加，SYBRGreenI染料荧光信号随之增强，通过荧光定量PCR仪

实时监测产物扩增情况，从而达到检测目的基因是否得到扩增。根据Ct值以及是否有“S”型扩增曲线

判定结果。

7试剂与材料

7.1引物

外引物扩增片段长度：269bp

外引物1(F3,5’-3’):GCGTTGCCGCCAACAATG

外引物2(B3,5’-3’):CATGCGGGCAACCTCTC

内引物1(FIP,5-3’):GTTGTCACCCCACCTCCGGGCGGCAACGTTCCTCC

内引物2(BIP,