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生物化学实验
生物化学实验
酵母核糖核酸的别离及组分鉴定
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一、实验目的
1.掌握RNA的提取方
2.学会使用地衣酚法测定RNA的含量
3.熟悉和掌握离心机的使用方
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二、实验原理
l由于RNA的来源和种类很多,因而提取制备方法也各异,一般有苯酚法、
去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的。组织匀浆用苯
酚处理并离心后,RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中,DNA和蛋白质那
么留在苯酚层中,向水层参加乙醇后,RNA即以白色絮状沉淀析出。此法
能较好地除去DNA和蛋白质,提取的RNA具有生物活性。
l酵母细胞富含核酸,且核酸主要是RNA,含量为干菌体的2.67%-10.0%,
而DNA含量较少,仅为0.03%-0.516%。为此提取RNA多以酵母为原料。工
业上制备RNA多项选择用低本钱、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这
两种方法所提取的核酸均为变性的RNA,主要用作制备单核苷酸的原料,
其工艺比较简单。
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二、实验原理
l稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解,然后用酸中和,除去蛋白
质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。提取的
RNA有不同程度的降解。浓盐法是用高浓度盐溶液处理,同时加热,以改
变细胞壁的通透性,使核酸从细胞内释放出来。
lRNA含有核糖、嘌呤碱/嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解,从
水解液中可用定糖,加钼酸铵沉淀〔或用定磷法〕和加银沉淀等方法测出
上述组份的存在。〔1〕嘌呤碱与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物沉
淀。〔2〕地衣酚显色法:核糖核酸与浓盐酸共热时,即发生降解,形成
的核糖继而转变为糠醛,后者与地衣酚〔3,5-二羟基甲苯〕反响呈鲜绿
色,该反响需用三氯化铁或氯化铜作催化剂。〔3〕磷酸与钼酸铵试剂作
用产生黄色的磷钼酸铵沉淀[(NH4)3PO4·12MoO3↓]。
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三、仪器、原料和试剂
l仪器:试管;
烧杯:100mL;
移液管:0.2mL(×1)、2.0mL(×2)、1mL(×2);
量筒:10mL、50mL各一个;
滴管;
电磁炉;
离心机;
布氏漏斗。
l原料:干酵母粉
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低速离心机
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三、仪器、原料和试剂
l试剂:
l〔1〕0.2%氢氧化钠溶液;
l〔2〕10%硫酸;
l〔3〕0.1mol/L硝酸银溶液〔5%硝酸银溶液〕;
l〔4〕1mol/L浓氨水;
l〔5〕酸性乙醇溶液:30mL乙醇加0.3mLHCl;
l〔6〕地衣酚试剂:100mg地衣
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