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胶乳免疫比浊法相关知识

很多公司开展了荧光胶乳免疫层析做定量分析及胶乳增强免疫比浊分析项目,

关注胶乳标记技术(de)技术人员越来越多.本人总结了部分胶乳微球标记技术,并

加以分类,以便朋友们查阅：

胶乳微球物理吸附：

反应微球带磺酸基、羧基、醛基表面(de)都是疏水微球,都可以用来设计被动吸附

蛋白.磺酸基微球表面含带有负电荷(de)磺酸基团,pka大约为2,因此在酸性pH保

持稳定.醛基微球表面也带有磺酸基团,但能和蛋白行程共价键.羧基微球表面含

带负电荷(de)羧基基团,在以上时保持稳定.

带有疏水基团(de)蛋白(de)吸附和配位结合,是最简单和直接(de)标记方法.这种

方法中,微球溶液和含目标蛋白(de)溶液混合,反应后,未结合(de)游离蛋白通过

清洗步骤除去,从而获得胶体蛋白复合物.疏水吸附方法只能用于疏水微球（硫酸

盐、羧基、醛基表面修饰(de)微球）.醛基表面修饰微球是一个特例,其疏水吸附

结果取决于后来(de)共价结合.虽然物理吸附是不依赖pH(de),但反应缓冲液

(de)pH对蛋白(de)结构有非常大(de)影响,从而影响蛋白吸附到微球上(de)反应

效率.一般,在被吸附蛋白等电点附近pH时,物理吸附效率会很高.

反应步骤：

1.用反应缓冲液系数蛋白到10mg/ml；

2.用反应缓冲液系数胶乳微球到1%；

3.将蛋白溶液加入到胶乳微球溶液中,10ml胶乳中加入1ml蛋白溶液.室温搅拌孵

育2hr；

4.离心或超滤,除去未结合蛋白；

5.将微球蛋白复合物用储存缓冲液溶解.

注意事项：

1.最优蛋白标记量影响因素

1）有效比表面积：粒径减小时,比表面积/mg微球值得增加；

2）胶体稳定性：蛋白对胶乳有稳定和去稳定作用；

3）免疫反应：最近标记量由免疫反应需要决定.

2.胶乳微球中加入蛋白后,快速搅拌混合,利于反应均衡.反应体积是1ml时,可用

移液器吸取蛋白加入微球中,并吹打数次.如果反应体积较大时,用烧杯,边搅拌边

加入蛋白,

3.储存缓冲液和反应缓冲液不同时,抗体有脱落(de)可能；

4.表面活性剂能使得抗体从胶乳中脱落,所以应避免加入.

微球共价结合抗体方法：

一、一步法

1.准备50mMpH(de)reactionbuffer,醋酸或MESbuffer更合适

2.用reactionbuffer溶解抗体,使其浓度为1mg/mL.

3.用reactionbuffer悬浮微球,使其浓度为1%w/v

4.边搅拌边将一倍体积(de)抗体溶液加入到10倍体积(de)微球悬液中,室温下持

续搅拌20分钟

5.准备浓度为10mg/ml（52umol/mL）(de)EDC溶液,用前准备,现配现用.

6.将计算需求量(de)EDC溶液加入到上述微球悬液中.(Note6).

7.室温下,立即调节pH(Note7).

8.移除未结合(de)蛋白,并将包被微球用storagebuffer重悬.(Note3and4)

B.两步法

为了避免EDC将相邻微球之间(de)蛋白偶联导致微球聚集或者蛋白之间交流,两步

法偶联抗体更合适.两步法中,在蛋白加入之前,多余(de)EDC被移除.两步法中,蛋

白也可以使用更高pH(de)buffer来溶解,从蛋白(de)稳定性方面和加速蛋白和活

化微球之间(de)交联速度方便考虑,是非常有利(de).

B1简单一步法：

1.准备50mMpH(de)活化buffer,醋酸或MESbuffer更合适；用活化buffer悬

浮微球,使其浓度为1%w/v

2.每ml微球悬液加入20mg(de)EDC,室温孵育20分钟,然后再次加入

20mg/mL(de)EDC,继续室温孵育20分钟.(Note7).

3.离心或超滤,用等体积(de)包被缓冲液清洗两次微球,最后悬浮在包被缓冲液

中.(Note3).

4.用包被缓冲液溶解抗体到1mg/mL,包被缓冲液pH7~9,浓度为50mM~100mM.(Note

1)

5.