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幽门螺杆菌分离培养和鉴定
1.实验设备:
CO气瓶、N气瓶、CO气袋、N气袋、厌氧培养瓶、负压泵、
2222
通气管道(带阀门)、培养箱、生物安全柜、酒精灯、接种环、普通
天平、电子天平、高压锅、玻片、显微镜、香柏油、平皿、三角瓶(带
盖)、10ml吸管、1ml吸管、吸头、200μl冻存管、细胞冻存管、普
通冰箱、低温冰箱(-80℃)、液氮罐、无菌滤器、加样器、无菌注射
器、眼科镊(带弯头)
2.实验材料:
牛脑心浸液或布氏肉汤、月示蛋白胨、胰胨、氯化钠、磷酸氢二
钠·12HO/无水、琼脂粉、抗生素(万古霉素、多粘菌素、二性霉素)、
22
羊血、葡萄糖(10%)、小牛血清、氢氧化钠(2M)、蒸馏水、甘油、
淀粉、pH试纸、革兰染液、快速尿素酶试纸、过氧化氢(3%)、氧
化酶试剂、β-环糊精、酵母提取物、重亚硫酸钠、蔗糖、淋球菌转运
培养基
3.有关试剂的配制:
(1)选择剂:万古霉素(10mg/l)、多粘菌素(2500U/l)、二性霉
素(10mg/l),三甲氧苄氨嘧啶(TMP)(5mg/l)。称量溶解后,采用
抽滤除菌,按照每次配制200ml培养基所需量(1ml)分装,-20℃
保存备用半年。(注意:二性霉素不易溶解,抽滤时多数被滤除)
(2)Hp培养基(牛脑浸液)配方:
1
牛脑浸液100ml、牛心浸液125ml、月示蛋白胨5g、氯化钠2.5g、
磷酸氢二钠1.25g,加水至500ml(加水275ml)、琼脂粉(1.5%)7.5g。
加热溶化后调pH至7.6-7.8。以200ml分装,灭菌。
血平板:200ml上述培养基中加入10%葡萄糖10ml(5%)、抗
生素1ml(0.5%)、羊血10ml,混匀后倒入无菌平皿。注:羊血需要
量入,不能够随便加入,要保证加入的量,宁多勿少(重庆医科大学
加7%)。
(3)Hp牛脑浸液培养基:上述未加琼脂粉的液体培养基20ml
加小牛血清2ml(10%),10%的葡萄糖1ml(5%)。一般不加抗生素,
如果加,按照0.5%加入。加淀粉0.1g(0.5%)。
(4)布氏琼脂:
月示蛋白胨10g、胰胨10g、氯化钠5g、磷酸氢二钠·12HO6.3g
22
(无水2.5g)、酵母提取物2g、重亚硫酸钠0.1g、β-环糊精2g,加水
1000ml。按照1.5%-2.0%加入琼脂粉,琼脂粉需要分开加,一般分装
到100-200ml时按量加入。加热溶化后,高压灭菌前调pH至7.7左
右。(经验:3000ml+2MNaOH8ml)
注意:培养基每次制备200ml或更少,用时,溶化琼脂,加入
一定量的葡萄糖、小牛血清或血液,加样用灭菌的吸管。扩增用培养
基(纯培养)不需要加入抗生素,临床标本分离用时必须加入抗生素。
(5)运送培养基:重庆医科大学采用淋球菌的运送培养基(改
良stuart运送培养基)/将胃粘膜组织置于小牛血清布氏肉汤运送培养
基中送检/蔗糖10g,经56℃灭活的小牛血清10ml,布氏肉汤100ml
2
(称取布氏肉汤粉剂2.8g,加蔗糖10g,加水90ml,高压灭菌,加小
牛血清10ml,无菌分装,4℃保存备用,7天内有效)。
(6)保存液:20%甘油+5%小牛血清+Hp液体培养基
4.样本采集和接种:
重庆医科大学
(1)胃镜处理:不能够用太浓的戊二醛,消毒结束后活检钳要
反复用自来水冲洗,活检钳头部要用干纱布把水擦干,以防活检钳中
储存消毒水,否则阳性率很低。
(2)标本取出后要防止
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