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幽门螺杆菌分离培养和鉴定

1．实验设备：

CO气瓶、N气瓶、CO气袋、N气袋、厌氧培养瓶、负压泵、

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通气管道（带阀门）、培养箱、生物安全柜、酒精灯、接种环、普通

天平、电子天平、高压锅、玻片、显微镜、香柏油、平皿、三角瓶（带

盖）、10ml吸管、1ml吸管、吸头、200μl冻存管、细胞冻存管、普

通冰箱、低温冰箱（-80℃）、液氮罐、无菌滤器、加样器、无菌注射

器、眼科镊（带弯头）

2．实验材料：

牛脑心浸液或布氏肉汤、月示蛋白胨、胰胨、氯化钠、磷酸氢二

钠·12HO/无水、琼脂粉、抗生素（万古霉素、多粘菌素、二性霉素）、

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羊血、葡萄糖（10%）、小牛血清、氢氧化钠（2M）、蒸馏水、甘油、

淀粉、pH试纸、革兰染液、快速尿素酶试纸、过氧化氢（3%）、氧

化酶试剂、β-环糊精、酵母提取物、重亚硫酸钠、蔗糖、淋球菌转运

培养基

3．有关试剂的配制：

（1）选择剂：万古霉素（10mg/l）、多粘菌素（2500U/l）、二性霉

素（10mg/l），三甲氧苄氨嘧啶（TMP）（5mg/l）。称量溶解后，采用

抽滤除菌，按照每次配制200ml培养基所需量（1ml）分装，-20℃

保存备用半年。（注意：二性霉素不易溶解，抽滤时多数被滤除）

（2）Hp培养基（牛脑浸液）配方：

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牛脑浸液100ml、牛心浸液125ml、月示蛋白胨5g、氯化钠2.5g、

磷酸氢二钠1.25g，加水至500ml（加水275ml）、琼脂粉（1.5%）7.5g。

加热溶化后调pH至7.6-7.8。以200ml分装，灭菌。

血平板：200ml上述培养基中加入10%葡萄糖10ml（5%）、抗

生素1ml（0.5%）、羊血10ml，混匀后倒入无菌平皿。注：羊血需要

量入，不能够随便加入，要保证加入的量，宁多勿少（重庆医科大学

加7%）。

（3）Hp牛脑浸液培养基：上述未加琼脂粉的液体培养基20ml

加小牛血清2ml（10%），10%的葡萄糖1ml（5%）。一般不加抗生素，

如果加，按照0.5%加入。加淀粉0.1g（0.5%）。

（4）布氏琼脂：

月示蛋白胨10g、胰胨10g、氯化钠5g、磷酸氢二钠·12HO6.3g

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（无水2.5g）、酵母提取物2g、重亚硫酸钠0.1g、β-环糊精2g，加水

1000ml。按照1.5%-2.0%加入琼脂粉，琼脂粉需要分开加，一般分装

到100-200ml时按量加入。加热溶化后，高压灭菌前调pH至7.7左

右。（经验：3000ml+2MNaOH8ml）

注意：培养基每次制备200ml或更少，用时，溶化琼脂，加入

一定量的葡萄糖、小牛血清或血液，加样用灭菌的吸管。扩增用培养

基（纯培养）不需要加入抗生素，临床标本分离用时必须加入抗生素。

（5）运送培养基：重庆医科大学采用淋球菌的运送培养基（改

良stuart运送培养基）/将胃粘膜组织置于小牛血清布氏肉汤运送培养

基中送检/蔗糖10g，经56℃灭活的小牛血清10ml，布氏肉汤100ml

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（称取布氏肉汤粉剂2.8g，加蔗糖10g，加水90ml，高压灭菌，加小

牛血清10ml，无菌分装，4℃保存备用，7天内有效）。

（6）保存液：20%甘油+5%小牛血清+Hp液体培养基

4．样本采集和接种：

重庆医科大学

（1）胃镜处理：不能够用太浓的戊二醛，消毒结束后活检钳要

反复用自来水冲洗，活检钳头部要用干纱布把水擦干，以防活检钳中

储存消毒水，否则阳性率很低。

（2）标本取出后要防止