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川西獐牙菜中苦龙胆酯苷的提纯及其抗肝纤维化作用机制研究

1研究背景肝纤维化是多种慢性肝病发展至肝硬化、肝癌的必经阶段,是肝

炎、肝硬化、肝癌三部曲的枢纽。目前,治疗肝硬化唯一有确切疗效的方法是肝

移植,但肝源的缺乏和原发疾病的复发等因素制约了肝移植疗法。

因此,阻断肝纤维化已成为慢性肝病治疗中的关键问题,肝纤维化的防治也

是当今国内外研究的重点和热点课题,但至今尚无理想的治疗肝纤维化的药物。

川西獐芽菜（SwertiamussotiiFranch）是藏药中最具传统特色的治疗肝胆病、

热症及血液病的常用药物,是我国治疗各种肝病的传统药材,但多采用全草入药,

鲜见对其功效成分及作用机制的研究。

川西獐牙菜中的苦龙胆酯苷（Amarogentin,AG）是一种裂环烯醚萜苷类化合

物,目前国内市场上鲜见高纯度AG的批量供应（中国生物制品检定所尚无对照品

供应）。众多研究表明AG具有保肝作用,但其是否具有抗肝纤维化作用还未见文

献报道。

为了研究和开发抗肝纤维化药物AG,首先必须解决从中药材即川西獐芽菜

中分离获得高纯度AG并实现规模化生产的工艺问题,其次是系统实施AG抗肝纤

维化作用及机制研究。籍此,本课题在建立川西獐牙菜中AG的提取、分离、纯化

工艺的基础上,通过体内和体外实验,旨在评价和探讨AG对肝纤维化的保护作用

和作用机制;同时通过观察AG对肝纤维化小鼠血清代谢谱的影响,从代谢通路的

角度进一步探讨其治疗肝纤维化可能的作用机制,为开发和研制中药有效成分抗

肝纤维化作用及其新药提供新思路。

2方法2.1川西獐牙菜中AG的提取、分离与鉴定:取川西獐牙菜粉,加入中

性磷酸盐缓冲液,充分混合冻融,离心除去杂质,得到滤液;将滤液除水后,向剩余

物中加入硫酸铵饱和溶液,沉降,离心分离得到AG粗品。称取柱色谱硅胶,加入氯

仿:甲醇的混合溶液,沉降,得到硅胶层析柱。

将AG粗品用少量乙醇溶解,加入硅胶拌匀,挥去溶剂,加到硅胶层析柱上。用

氯仿:甲醇做洗脱剂进行梯度洗脱,AG纯品做对照,薄层层析法跟踪监测,待AG呈

单一斑点时收集洗脱液。

将收集的洗脱液旋转蒸发、浓缩、纯化得到AG纯品。运用理化常数测定和

波谱数据分析等手段鉴定了AG的结构,并进行了3批中试研究。

2.2AG对TGF-βsub1/sub诱导的HSC-T6细胞影响的体外实验研究:体

外培养肝星状细胞（HSC-T6）,随机设立正常对照组,TGF-βsub1/sub刺激的

肝纤维化模型组,TGF-βsub1/sub+AG（0.01mg/mL）低剂量组,TGF-β

sub1/sub+AG（0.1mg/mL）中剂量组,TGF-βsub1/sub+AG（1.0mg/mL）

高剂量组。采用CCK-8法检测不同浓度TGF-βsub1/sub对HSC-T6细胞的影

响和不同浓度AG的干预对TGF-βsub1/sub诱导的HSC-T6细胞的影响;采用

ELISA法检测AG作用于TGF-βsub1/sub诱导的HSC-T6培养上清中TNF-α、

IL-1β、IL-6浓度的影响;采用WesternBlot检测不同浓度AG作用于TGF-β

sub1/sub诱导的HSC-T6中α-SMA和MAPK通路中JNK、ERK、p38蛋白及其

磷酸化的表达水平。

2.3AG对CClsub4/sub所致小鼠肝纤维化的体内实验研究:雄性

C57BL/6J小鼠随机分为正常组、模型组、秋水仙碱组（即阳性对照组）和AG低

剂量（25mg/kg）、中剂量（50mg/kg）、高剂量（100mg/kg）给药组。除正常

组外,其余各组采用皮下注射20%CClsub4/sub6mL/kg,每周2次,连续7周

的方法诱导肝纤维化小鼠模型。

自造模第2周起,正常组和模型组给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液,给药组分

别给予相应的受试药物,连续6周每天给药1次。试验结束后,取血清和肝组织分

别检测ALT、AST、Alb及MDA、SOD、GSH-Px、Hyp生化指标的变化;取固定部位

肝组织,HE、Masson、SiriusRed染色观察肝纤维化程度;免疫组织化学法和

WesternBlot观察α-SMA蛋白的表达;WesternBlot测定TGF-β

sub1/sub/Smad通路中TGF-βsub1/sub、p-Sm