《肉及肉制品中鸡鸭源性成分的鉴定梯型熔解温度等温扩增检测方法》编制说明（征求意见稿）.docx

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T/HNSPXHXXX—XXXX肉及肉制品中鸡鸭源性成分的鉴定梯型熔解温度等温扩增检测方法

1范围

本文件规定了肉及肉制品中鸡鸭源性成分的梯型熔解温度等温扩增检测方法。

本文件适用于肉及肉制品中鸡鸭源性成分的定性检测。

本文件所规定方法的检出限（LOD）为0.1%（质量比）。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T9695.19肉与肉制品取样方法

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4方法提要

提取样品DNA，用已知含鸡肉、鸭肉成分的样品DNA为阳性对照，已知不含鸡肉、鸭肉成分的样品DNA为阴性对照，灭菌双蒸水作为空白对照，使用特异性引物和探针，采用梯型熔解温度等温扩增技术，根据荧光信号和扩增现象，判定是否存在鸡肉、鸭肉成分。

5原理

选择Tm值曲线为梯型（包括人字梯型、半人字梯型和直梯型）的特异性核酸片段为靶序列设计巢式引物，将巢式引物的外引物与内引物分别连接成一对引物作为等温扩增用引物，借助外引物与核酸靶序列上对应片段的熔解温度差异提供单链模板，在DNA聚合酶（大片段）催化下通过合成反应与链替代反应对梯型Tm值曲线的靶标核酸片段进行等温扩增，进行不同肉类成分的定性分析。

6试剂或材料

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除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682中一级水的规格。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。

6.1动物组织DNA提取试剂盒。

6.2梯型熔解温度等温扩增检测LMTIA试剂盒。Proofman探针法

6.3梯型熔解温度等温扩增检测LMTIA的引物和探针。鸡肉、鸭肉引物和探针详见表1。鸡肉和鸭肉引物扩增的靶标序列参见附录A。

6.4梯型熔解温度等温扩增检测反应混合液（5μL（2X）通用型LMTIA预混液，0.4μL(100U/μL)(U,Unit，酶学单位)Bst酶）。

表1鸡肉、鸭肉成分鉴定用引物和探针序列

名称

序列(5’→3’)

靶基因

鸡肉

正向引物F:GACGCCCGGCCTCGTTTTAGTCGTAACAAGGTTTCCGT

ITS

反向引物B:GCGTCCGGCCGAGCTTTTGGAAGGGAAGGGAAGGCTG

环引物LF:TCCTTCCGCAGGTTCAC

环引物LB:ACGAGCGCGCGCGGG

探针:BHQ2-TCCTTCCGCAGGTTA-6-FAM

鸭肉

正向引物F:CAGCCCCGGTAATGATTTTAGTCGTAACAAGGTTTCCGT

ITS

反向引物B:ACCGGGGCTGGGCCTTTTGGGCTCCGTCGCTCAC

环引物LF:CTTCCGCAGGTTCACCT

环引物LB:GGCTTGGGCGTCGCA

探针:BHQ2-GGCTTGGGCGTCT-JOE

7仪器设备

7.1等温荧光扩增仪。

7.2恒温水浴锅。

7.3离心机：离心力≥12000g。

7.4微量移液器：0.5μL~10μL,10μL~100μL,20μL~200μL,200μL~1000μL。

7.5恒温混匀仪。

7.6涡旋震荡器。

7.7pH计，精度为0.01。

7.8天平：感量0.01g。

7.9微量紫外-可见分光光度计。

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8检测步骤

8.1DNA提取

应采用市售的动物组织DNA提取试剂盒提取。

注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μL，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用双蒸水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃,以防DNA降解。

8.2DNA浓度与纯度的检测

使用核酸蛋白仪或微量紫外-可见分光光度计检测提取DNA的浓度与纯度。分别检测260nm和280nm处的吸光值，每个样品重复测三次，取平均值。当A260/A280比值在1.6～2.0时，可用于LMTIA扩增。

8.3梯型熔解温度等温扩增

8.3.1梯型熔解温度等温扩增反应体系

梯型熔解温度等温扩增反应体系见表2。PCR八联管中按表1依次加入反应试剂，混匀。放入等温荧光扩增仪。

表2梯型熔解温度等温扩增反应体系（10μL）

试剂

体积(μL）