蜂王浆中蜂王浆主蛋白4的测定 酶联免疫吸附法.docx

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蜂王浆中蜂王浆主蛋白4的测定酶联免疫吸附法

1范围

本文件描述了蜂王浆中蜂王浆主蛋白4的酶联免疫吸附法。

本文件适用于蜂王浆及蜂王浆冻干粉中蜂王浆主蛋白4含量的测定。

注：蜂王浆主蛋白4是蜂王浆主蛋白之一，其含量能够反映蜂王浆新鲜度。

本文件方法的检出限为6.57mg/kg，定量限为62.5mg/kg。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

采用双抗体夹心酶联免疫吸附法测定蜂王浆主蛋白4的含量。蜂王浆主蛋白4的一对不同表位的鼠源单克隆抗体，与蜂王浆主蛋白4特异性结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体的免疫复合物，加底物显

色后，在450nm波长下测定吸光值，根据吸光值计算蜂王浆主蛋白4浓度，外标法定量。

5试剂或材料

除非另有说明，仅使用分析纯试剂。

5.1水：GB/T6682，三级。

5.2检测试剂盒及其试剂见附录A。

5.3按试剂盒说明书配制所需溶液。

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6仪器设备

6.1酶标仪：检测波长精度±2nm。

6.2分析天平：精度为0.0001g。

6.3冷冻离心机：转速不低于12,000r/min。

6.4涡旋振荡器。

6.5恒温培养箱：精度±1℃。

6.6超声波清洗仪。

7样品

蜂王浆200g于密闭容器中，-18℃储存不超过2个月；蜂王浆冻干粉200g于密闭容器中，4℃以

下储存不超过2个月。

8试验步骤

8.1提取

平行做两份试验。称取约1g试样（精确至0.001g）于50mL离心管中，加水40mL，室温下充分震荡20min，或20℃以下超声10min，转移至50mL容量瓶中。离心管用少量水洗涤3次，洗液并入

容量瓶中，并定容至50mL，混匀。取适量溶液于4℃、12,000r/min离心15min，上清液备用。

8.2稀释

8.2.1蜂王浆

准确移取50μL上清液（8.1）于10mL容量瓶中，用水稀释定容至10mL，混匀，为待测试样溶液。

8.2.2蜂王浆冻干粉

准确移取25μL上清液（8.1）于10mL容量瓶中，用水稀释定容至10mL，混匀，为待测试样溶液。

8.3测定

按照检测试剂盒所述操作步骤对待测试样溶液进行测定。

8.4空白试验

空白试样采用水替代试样，按上述步骤进行测定。

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8.5阳性质控

取任一试样，根据其蜂王浆主蛋白4的含量，选择一个合适的浓度进行添加，以确定试验过程的操

作准确性。

8.6标准曲线绘制

根据对照品质量浓度与吸光度变化关系绘制标准曲线，相关系数不低于0.99。试样溶液中蜂王浆主蛋白4的浓度应在标准曲线的线性范围内。如果试样中蜂王浆主蛋白4含量超出线性范围，则用样本稀

释液稀释（n倍），重新测定。

9试验数据处理

蜂王浆中蜂王浆主蛋白4的含量以质量分数w计，数值以毫克每千克（mg/kg）表示，按式（1）

计算：

X=......................（1）

式中：

C——从标准工作曲线上得到的试样溶液中蜂王浆主蛋白4浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

V——试样液体积，单位为毫升（mL）；

n——试样液稀释倍数；

m——试样质量，单位为克（g）；

测定结果以平行测定的算术平均值表示，表示到小数点后两位。

10精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过该算术平均值的20％。

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附录A

（资料性）

蜂王浆主蛋白4测定试剂盒

A.1包被好抗体的酶标板。

A.2蜂王浆主蛋白4对照品（纯度80%）。

A.3样本稀释液。

A.4生物素标记抗体。

A.5生物素标记抗体稀释液。

A.6辣根过氧化物酶标记亲和素。

A.7辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液。

A.8浓洗涤液。

A.9底物溶液。

A.10终止液。

A.11板贴。