第五章-分子生物学研究法(上).ppt

思考题：P192：2，3，5，7，84、分子信标（molecularbeacon）技术是一种呈茎环结构的荧光标记的寡核苷酸，环状区与靶序列特异性结合，茎干区由5-8个碱基对组成，5’端带有荧光发生基团，3’端带有荧光淬灭基团。自由状态时，分子信标呈发卡式结构，荧光几乎完全淬灭。与靶分子相结合时，荧光基团和淬灭基团之间的距离增大，分子信标的荧光恢复。Taqman技术（上）及分子信标技术（下）原理示意图。在多细胞的高等生物个体水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotictwins）便是属于同一克隆。5.5基因克隆（clone）技术在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞（progenitorcell）分裂而来的一群带有完全相同遗传物质的子细胞。在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。5.3RNA基本操作技术真核生物基因组DNA庞大，有大量重复序列，很难直接分离得到靶基因片段。而cDNA来自反转录的mRNA，无冗余序列，通过筛选cDNA文库，可较快地分离到相关基因。细胞中的总RNA包括mRNA，rRNA，tRNA以及一些小RNA（sRNA）。一个典型的动物细胞约含10-5μgRNA，其中：80%-85%为rRNA15%-20%为tRNA及sRNAmRNA约占总RNA的1%-5%rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，特别是28S和18S特征性条带是电泳鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。LiQetal.(2006)J.Integr.PlantBiol.48:114-120.图5-14PolyATtractmRNA的分离纯化过程简图。RNA的浓度和纯度可以通过测定其OD260和OD280来判断。OD260为1时相当于浓度为40μg/ml，而OD260/OD280的比值如果在1.8-2.0之间，表示所提取的RNA纯度较好，如果样品中有蛋白质或酚污染，则OD260/OD280的比值将明显低于1.8。由于RNA分子敏感脆弱，在自然状态下难以被扩增，为了研究mRNA所包含的功能基因信息，一般将其反转录成稳定的DNA双螺旋（cDNA，complementaryDNA），再插入到可以自我复制的载体中。图5-15cDNA合成过程示意图。cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录为cDNA，有反转录酶催化，该酶合成DNA时需要引物引导，常用引物是oligodT。第二链合成是以第一链为模板，由DNA聚合酶催化。图5-16定向cDNA合成及分子修饰CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5-甲基胞嘧啶的外源DNA，所以实验中常选用mcrA-mcrB-菌株以防止cDNA被降解。cDNA文库的构建cDNA的长度一般在0.5-8kb之间，质粒载体和噬菌体类载体都能满足要求。cDNA文库常用Uni-zapXR（一种λ噬菌粒载体）做载体，它具备噬菌体的高效性和质粒载体系统利用蓝白斑筛选的便利，可容纳0-10kbDNA插入片段，含有pBluescript载体的全部序列。重组后可通过体内剪切反应（InVivoExcision）将cDNA插入片段转移到质粒系统中进行筛选、克隆和序列分析。基因文库的筛选基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。筛选的方法有很多种，如核酸杂交法，PCR筛选法和免疫筛选法等。1、核酸杂交法：核酸杂交法以其广泛的适用性和快速性成为基因文库筛选中最常用的一种方法，用放射性标记的特异DNA探针适用于高密度的菌落杂交筛选。将待筛选菌落转移到硝酸纤维素膜上，适当温育。同时保留原来的菌落平板作对照。取出已经长有菌落的膜，用碱液处理，使菌落发生裂解，DNA随之变性。用蛋白酶K处理硝酸纤维素膜去除蛋白质，形成菌落DNA的印迹。80℃烘烤滤膜，将DNA固定在膜上。将滤膜与放射性标记的DNA或RNA探针杂交，通过放射性自显影显示杂交结果。通过对应于平板上的位置找到相应克隆。图5-17