细胞表面分子的检测与分析.ppt

“A门”内CD3/CD4的表达第31页,共44页，星期六，2024年，5月“A门”位置变化引起的改变第32页,共44页，星期六，2024年，5月“A门”位置变化引起的改变第33页,共44页，星期六，2024年，5月第34页,共44页，星期六，2024年，5月小鼠脾细胞CD3+/CD4+的表达第35页,共44页，星期六，2024年，5月流式检测胞内细胞因子步骤1、肝素钠抗凝血1ml+1ml不完全1640培养液混匀，铺24孔板1孔。2、PMA（终浓度100ng/ml）+Ionomycin（终浓度1μg/ml），37℃5%CO2刺激2h。3、2h后加入阻断剂Monensin（终浓度2.5μmol/ml）混匀，继续培养4h。4、培养结束后，1500rpm*5min离心去上清。5、表面分子染色。取7只流式检测试管，每管中加入100μl压积血，按下列表格内容加入抗体染色，4℃避光染色30min。管号检测内容荧光抗体1空白对照无2荧光补偿管FITC-CD35μl3荧光补偿管PE-CD85μl4荧光补偿管Pecy5-CD85μl5荧光补偿管APC-CD35μl6同型对照APC-CD3;Pecy5-CD87测试管APC-CD3;Pecy5-CD8第36页,共44页，星期六，2024年，5月6、溶血。各管内加入1mlBD溶血剂，混匀，室温避光静置10min，1500rpm*5min离心去上清。SB染色缓冲液1ml/管洗一次，1500rpm*5min离心去上清，混匀沉淀细胞。7、固定。各管内加入500μl2%PFA固定剂，4℃避光固定30min。1500rpm*5min离心去上清。SB染色缓冲液1ml/管洗两次，1500rpm*5min离心去上清，混匀沉淀细胞。8、透膜。各管内加入500μl透膜液，4℃避光10～15min。1800rpm*5min离心去上清。9、封闭。6、7号管加入25μl封闭液。（5μl小鼠血清+20μl10%BSA)4℃避光30min。10、胞内染色。6号管内加入同型对照抗体FITC-mIgG1和PE-mIgG1各2μl；7号管内加入抗体FITC-IFNg和PE-IL17各5ul。4℃避光染色30min后透膜液500μl/管洗一次,SB染色缓冲液1ml/管再洗一次。11、上机检测。2%PFA固定剂300μl/管混匀重悬4℃放置待检。第37页,共44页，星期六，2024年，5月第38页,共44页，星期六，2024年，5月流式检测外周血Treg细胞步骤1、采集静脉血2ml于肝素钠抗凝管内。2、表面分子染色。取7只流式检测试管，每管中加入100μl抗凝血，按下列表格内容加入抗体染色，4℃避光染色30min。管号检测内容荧光抗体1空白对照无2荧光补偿管FITC-CD45μl3荧光补偿管PE-CD45μl4荧光补偿管Pecy5-CD35μl5荧光补偿管APC-CD35μl6同型对照Pecy5-CD3;FITC-CD4;PE-mIgG17胞内同型对照Pecy5-CD3;FITC-CD4;PE-CD258测试管Pecy5-CD3;FITC-CD4;PE-CD25第39页,共44页，星期六，2024年，5月3、溶血。各管内加入1mlBD溶血剂，混匀，室温避光静置10min，1500rpm*5min离心去上清。SB染色缓冲液1ml/管洗一次，1500rpm*5min离心去上清，混匀沉淀细胞。4、固定。各管内加入500μl2%PFA固定剂，4℃避光固定30min。1500rpm*5min离心去上清。SB染色缓冲液1ml/管洗两次，1500rpm*5min离心去上清，混匀沉淀细胞。5、透膜。各管内加入500μl透膜液，4℃避光10～15min。1800rpm*5min离心去上清。6、封闭。7、8号管内加入25μl封闭液。（5μl小鼠血清+20μl10%BSA)4℃避光30min。7、胞内染色。7号管内加入同型对照抗体APC-mIgG2a2μl；8号管内加入抗体APC-Foxp32ul。4℃避光染色30min后透膜液500μl/管洗一次,SB染色缓冲液1ml/管再洗一次。8、上机检测。2%PFA固定剂300μl/管混匀重悬4℃放置待检。第40页,共44页，星期六，2024年，5月第41页,共44页，星期六，2024年，5月溶液配方BD溶血剂（50ml)：枸橼酸钠1.25g溶于21ml超纯水中，完全溶解后加