利什曼原虫检测 涂片镜检法.docx

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WS/T10018—2024

利什曼原虫检测涂片镜检法

1范围

本文件措述了骨髓和皮肤组织液涂片镜检法检测利什曼原虫的检测方法。

本文件适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对人体利什曼原虫的显微镜检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

WS233病原微生物实验室生物安全通用准则

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

利什曼原虫Leishmaniaspp.

一类可以引起利什曼病的寄生性的单细胞真核生物。不同种利什曼原虫感染可导致人内脏利什曼病 (visceralleishnaniasis)或称黑热病(kala-azar)、皮肤利什曼病(cutaneousleishmaniasis)或黏膜皮肤利什曼病(mucocutaneousleishnaniasis)

3.2

利什曼原虫无鞭毛体Leishaniaamastigote

寄生于人体和哺乳动物单核巨噬细胞内的利什曼原虫，其鞭毛萎缩而不可见，虫体呈圆形或卵圆形，

无运动能力3.3

骨随涂片bonemarrowsmear

骨髓穿刺液涂于载玻片上制成的涂片3.4

皮肤组织液涂片darmaltissuefluidsmear

皮肤组织液涂于载玻片上制成的涂片

4仪器设备

4.1光学显微镜(100×油浸物镜、10×目镜)

4.2涂片染色架。

4.3涂片干燥架。

4.4染色盘。

4.5医疗污物桶。

5试剂或材料

5.1吉氏粉。

5.2瑞氏粉。

5.3pH7.2磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline,PBS)。

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5.4甲醇(分析纯)。

5.5专用浸油或香柏油(折射率≥1.5)。5.6二甲苯(分析纯)。

5.7载玻片(无划痕无油污的洁净载玻片)。

6检测步骤

6.1涂片的制作

6.1.1编号

取3张洁净载玻片，分别在每张玻片一侧标注编号。

6.1.2骨髓涂片的制作

对于疑似内脏利什曼病患者，采用骨髓穿刺方法采集骨髓。立即在距离每张载玻片编号端1/3处滴加约20μL骨简穿刺液，另取1张边缘光滑的载玻片作为推片，将推片下缘平抵骨简穿刺液前侧，当骨髓穿刺液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cn宽时，使2张玻片保持25°~35°角，从编号端向另一端迅速推成舌状涂片(见附录A)。室温干燥。

6.1.3皮肤组织液涂片的制作

对于疑似皮肤利什曼病患者，在皮肤结节边缘或者皮肤溃疡处吸取或刮取组织液，置于载玻片上(每张载玻片5μL~20μL),按上述方法制作涂片。室温干燥。

6.2染色液的配制

6.2.1吉氏染液的配制(见附录B)。

6.2.2瑞氏染液的配制(见附录B)。

6.3涂片染色

用吉氏染液或瑞氏染液染色，染色方法和涂片保存见附录C。

6.4镜检

在染色晾干后的涂片上加1滴专用浸油或香柏油，在光学显微镜(100×油浸物镜、10×目镜)下检查。

7结果判定

7.1利什曼原虫检测阳性

涂片中查到利什曼原虫无鞭毛体，该涂片判定为阳性(见附录D)。7.2利什曼原虫检测阴性

观察1000个以上视野而没有发现利什曼原虫无鞭毛体，该涂片判定为阴性。

8废弃物处理

所有样品、洗涤液和各种废弃物均应按照S233病原微生物实验室生物安全通用准则的规定进行处理。

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附录A(资料性)

涂片的制作方法示意图

骨髓和皮肤组织液涂片制作示意图见图A.1。

1.在玻片一侧编号。

2.在距离玻片编号端1/3处滴加约20μl骨髓穿刺液或5μl~20μl皮肤组织液，推片下缘平抵液滴前侧。

3.当液滴在两张玻片间扩展至约2cm时，使两张玻片保持25°~35°角。

4.将推片迅速从编号端向另一端推进。

5.涂片可分为头、体、尾三部分，在尾部舌状区域

易检出利什曼原虫无鞭毛体。

图A.1涂片制作示意图

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附录B (资料性)染液的配制

B.1吉氏染液配制

B.1.1吉氏染色原液的配制

吉氏粉5.0g,甲醇250mL,甘油250nL。

将吉氏粉置于研体中，加入少量甘油充分研磨，然后边加边磨，至甘油加完为止，而后倒入500mL具塞深色玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇，洗掉剩余部分，倒入瓶内，再次加甲醇，洗后再倒入瓶中至