细胞免疫检测技术.ppt

图注：ELISPOT法在检测低频率产生细胞因子的细胞时具有独一无二的敏感性。将指定数目的能产生IFN-的T细胞与一百万个抗原呈现细胞（AntigenPresentingCells，APC）混合后，使用ELISPOT法（上图）、胞质内染法（中图）和ELISA法（下图）分别测量产生IFN-的细胞的数目。第23页,共39页，星期六，2024年，5月第24页,共39页，星期六，2024年，5月

6.T淋巴细胞转化实验T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。检测技术第25页,共39页，星期六，2024年，5月植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA），抗CD2、抗CD3McAb作为多克隆刺激剂可选择性地刺激T细胞增殖；抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌体（SAC）、脂多糖（LPS，对小鼠有作用）则刺激B细胞发生增殖；美洲商陆（PWM）、肿瘤刺激剂PMA对T、B细胞的增殖均有刺激作用。第26页,共39页，星期六，2024年，5月淋巴细胞转化试验方法形态计数法MTT法同位素掺入法第27页,共39页，星期六，2024年，5月形态计数法加分裂原共同培养后，观察形态学变化，计算转化为母细胞的百分数细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加,即向淋巴母细胞转化。第28页,共39页，星期六，2024年，5月MTT法MTT法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。MTT是一种噻唑盐，化学名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。细胞受到ConA作用后发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTT作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经溶剂溶解后为蓝色溶液，可用酶标测定仪测定细胞培养物的OD值，测定波长570nm。根据OD值的大小计算反应体系中细胞增殖程度。

第29页,共39页，星期六，2024年，5月同位素法3H-TdR掺入法：细胞增殖的基本条件或前提为细胞质和细胞核的复制，这是正常细胞增殖过程缺一不可的前提。3H-TdR即（甲基-3H）胸腺嘧啶核苷，是DNA合成的前体。加入细胞培养液中后被细胞摄取作为DNA合成的原料。细胞合成的DNA越多，则所掺入的3H-TdR就越多，因此，检测所掺入的3H-TdR就可反映细胞增殖的程度。因该方法有同位素污染问题，故我们实习中仍用MTT法。

第30页,共39页，星期六，2024年，5月同位素法优势3H-TdR=增殖细胞数；MTT=总细胞数。所以前者更能反映细胞增殖指数。例，培养10个细胞，3天后A组为17个，B组为13个，此为MTT的结果；3H-TdR的结果则为7：3，A组细胞的增殖是B组的2.3倍。第31页,共39页，星期六，2024年，5月实验步骤1、鸡脾淋巴细胞悬液制备淋巴细胞的分离用1640培养液配成106细胞/ml第32页,共39页，星期六，2024年，5月2、淋巴细胞增殖反应将脾细胞悬液加入到96孔培养板中，200μL/孔，每一份脾细胞悬液分装6个孔，3孔加ConA（5ug/mL），另3个孔不加ConA作为对照。置5%CO2，37℃培养72h，培养结束前6h，每孔加入3H-TdR20μL，使其终浓度为（3.7-18.5）×104Bq/mL。用多头细胞收集器将细胞取集于玻璃纤维滤纸上。滤纸片充分干燥后置测量瓶中，加入7mL闪烁液，用液闪仪测定每分钟脉冲数（cpm）。3、数据处理及结果判定以每分钟脉冲数（cpm）表示增殖程度，用刺激指数（SI）来表示???????????????????????????实验孔cpm

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????????????????????????????????对照孔cpm受试样品组的SI值显著高于对照组的SI值，即可判定该项实验结果阳性。第33页,共39页，星期六，2024年，5月原儿茶酸对SPF鸡的免疫刺激试验PoultryScience,2012,91:1604–1609第34页,共39页，星期六，2024年，5月淋巴细胞分离液的原理外周血中各种血细胞的密度不同，其中红细胞密度为1.093，粒细胞密度为1.092，淋巴细胞为1.074±0.001。主要成分：葡聚糖，泛影葡甲胺，氢氧化钠（1.0770-1.0800克/毫升）用培养液调成106细胞/ml第35页,共39页，星期六，2024年，5月鸡外周血淋巴细胞增殖实验加液：离心：计数4.铺板5.检测第36页,共39页，星期六，