分子克隆技术(讲稿).pptx

分子克隆技术

MolecularCloning;基因工程（geneengineering）：将基因进行克隆，并利用克隆的基因表达、制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改造细胞和生物个体的特性所用的方法及相关的工作。;主要内容;第一节工具酶;限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease，简称限制酶）：是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。;第一节工具酶

一、限制性核酸内切酶;;（二）Ⅱ型限制性核酸内切酶的作用

Ⅱ型限制酶能识别双链DNA特异的4?6个碱基对，并在此序列内特异切割DNA。

限制酶功能：根据需要在特定的位点上精确切割双链DNA分子。;5?——GAATTC——3?;第一节工具酶

一、限制性核酸内切酶;11;第一节工具酶

一、限制性核酸内切酶;（一）DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（E.ColiDNApolymeraseⅠ）是单一多肽链的多功能酶，分子量为109kD，它具有3种酶活性：

①5?→3?DNA聚合酶活性。

②3?→5?核酸外切酶活性。

③5?→3?核酸外切酶活性。;Klenow片段的主要用途：

①补齐双链DNA的3?末端，同时可使3?末端DNA标记上同位素。

②cDNA克隆中，合成cDNA第二链。

③DNA序列分析。;（二）TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶（简称Taq酶）是一种耐热的DNA聚合酶，分子量为65Kd，最佳作用温度是70~80℃，Taq酶具有5?→3?聚合酶活性和依赖于聚合作用的5?→3?外切酶活性。

TaqDNA聚合酶可用于DNA测序及通过聚合酶链反应（PCR）对DNA分子的特定序列进行体外扩增。;（三）逆转录酶

逆转录酶（reversetranscriptase）是依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板，4种dNTP为底物，催化合成DNA，此过程称为逆转录过程。逆转录酶是多功能酶。;;（四）末端脱氧核苷酰转移酶

末端脱氧核苷酰转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT，简称末端转移酶）：分子量为60Kd，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3?末端-OH上。;(A、G、C、T)n;DNA连接酶（DNAligase）：称为基因工程的缝纫针，它在DNA重组中的主要功能是催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子的5?磷酸基团与3?羟基形成磷酸???酯键，将具有相同粘性末端或平末端的DNA连接起来，实现DNA体外重组。

DNA连接酶包括大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶两种类型。;碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的5?-磷酸基团。

主要用途有：

①除去DNA片段上的5?磷酸以防自身连接。

②在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标记前，从RNA或DNA上除去5?端的磷酸。;第一节工具酶

五、T4多核苷酸激酶;核酸酶S1可水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交分子中的单链部分。

其主要作用有：

①除去粘性末端以产生平末端。

②除去cDNA合成时形成的发夹结构。

③分析RNA的茎环结构和DNA-RNA分子的杂交情况。;第二节载体;;载体应具备的特征：

①能自我复制并具较高的拷贝数。分子量一般10Kb。

②带有遗传筛选标记。

③有适当的限制酶切位点，便于外源基因的插入和筛选。;（一）质粒载体;复制起始点;;图4-6pUC质粒物理图谱;;第二节载体

一、克隆载体;外源目的基因在新宿主细胞中是否克隆成功，是通过鉴定克隆是否表达的方法来证实，即产生克隆基因所编码的蛋白质，其每个环节都至关重要。

真核基因在原核细胞中表达需要有效转录及一系列调控元件，必须保证外源基因－－插入方向的正确性；受原核启动子的控制；必须能在大肠杆菌中有效转录和有效翻译。

基因表达、合成有功能的蛋白质依赖于基因的有效转录、mRNA正确的翻译和翻译后加工。;（一）原核细胞表达载体

原核细胞的表达载体主要是大肠杆菌表达载体。外源基因在原核细胞中表达需要重要调控元件。大肠杆菌表达载体是在克隆载体的基础上导入表达系统调控元件：启动子—核糖体结合位点—克隆位点—转录终止信号。;第二节载体

二、表达载体;（一）原核细胞表达载体

2.SD序列;（一）原核细胞表达载体

终止子：一个基因的3?末端有一特定的D