《动物传染病实验》课件：3-血凝和血凝抑制试验.pptVIP

实验二血凝和血凝抑制试验

HemagglutinationandHemagglutinationInhibition,

HAandHI2012－10－26一、实验目的二、实验原理三、实验材料四、操作步骤五、结果判定理解血凝试验和血凝抑制试验的原理熟练掌握血凝试验和血凝抑制试验的操作方法熟练应用血凝试验和血凝抑制试验检测或监测禽流感和新城疫的抗体水平、及疾病诊断。一、实验目的二、实验原理

（一）血凝试验（HA）一些病毒的表面具有血凝素，能够促使某些动物，如鸡、鹅、豚鼠和人的红细胞发生凝集，叫做血凝试验。凝集红细胞可以作为鉴定具有血凝特性的病毒的一个指标。凝集效价:能使血球完全凝集（红细胞发生100%凝集）的病毒最高稀释度为病毒的凝集效价。可反映病毒的相对含量。1.对于病毒和病毒血凝素使红细胞发生凝集的原理,不同的病毒有所不同。痘类和天花病毒是由类脂蛋白引起的凝集。流感和新城疫是作用于红细胞表面的一种受体（一种糖蛋白）而引起凝集。HA试验的原理图2.病毒的血凝现象大致可以分为3种类型:1)?病毒血凝素与完整成熟的病毒颗粒结合较密切，不经特殊化学方法处理不能分开。例如流感、腮腺炎、新城疫等病毒，病毒释放N-乙酰神经氨酸酶破坏了红细胞受体表面的糖苷键，病毒游离下来后，红细胞不能再次被凝集。Why？2）病毒血凝素与完整成熟的病毒颗粒易于分开,血凝素呈游离状态,例如天花、牛痘、鼠痘等病毒,它们的凝集现象是可逆的。3）脑炎病毒、口蹄疫病毒等,凝集红细胞的条件很严格,对红细胞的种类有很严格的选择,同时还要掌握反应的pH和温度等。（二）血凝抑制试验（HI）当病毒悬液中加入特异性抗体时,这种红细胞凝集的现象就被抑制,称红细胞凝集抑制试验,也叫血凝抑制试验。因此,可以用已知病毒来检测被检血清中的相应抗体,从而对血清抗体水平进行评价,评估疫苗的免疫效力。例如通过新城疫抗体的检测,来评估免疫是否合格,是否需要加强免疫。同样,可以用已知血清来鉴定未知病毒。例如应用新城疫或禽流感的特异性血清来区分同样具有血凝特性的新城疫病毒或禽流感病毒。或用于禽流感病毒HA亚型的鉴定。HI试验的原理图血凝抑制效价:能完全抑制红血球凝集的最高血清稀释度即为该血清的血凝抑制效价。新城疫疫苗免疫的抗体效价要求大于等于1：25，为新城疫疫苗免疫合格，产生的抗体可以提供保护；小于1：23时，不能产生较高的保护效力。可以评估鸡群的感染风险？是否需要加强免疫？三、试验材料鸡新城疫病毒（NDV）鸡红细胞:采集健康鸡血液，以阿氏液抗凝，以生理盐水洗涤3~5次，将血浆、白细胞等充分洗去，用生理盐水配置成1%红细胞悬液使用。0.85%生理盐水。待检灭活血清:某新城疫疫苗免疫鸡场的血清，56℃处理30min灭活，用于检测新城疫抗体效价，分析是否需要加强免疫。血凝板（V型微量反应板）、移液器、Tip头四、操作步骤

（一）血凝试验（HA）在血凝板第一排的1~12孔加入25μl生理盐水。在第1孔中加入25μl病毒抗原，反复吸取混匀后吸50μl到第2孔，如此倍比稀释直到第10孔，混匀后弃25μl；最后两孔（11.12）为红细胞对照。将1%的红细胞轻轻摇动混匀，在1~12孔中每孔加入25μl。手工震荡，37℃静置30-40min后观察结果。病毒血凝价结果观察（血凝价是1：？）。凝集效价:能使血球产生完全凝集（红细胞发生完全凝集）的病毒最高稀释度为病毒的凝集效价。可反映病毒的相对含量。只有红细胞对照为“-”时试验结果方可成立。血凝滴度以“完全凝集”为终点,作为血凝价的终点,即一个血凝单位。一个血凝单位是指使红细胞发生完全凝集的病毒悬液的最高稀释倍数（1:2n）。1:211:221:231:241:251:261:271:281:291:210CC以红细胞发生完全凝集的病毒悬液的最高稀释度作为血凝价,即1个血凝单位。强凝集现象！（二）血凝抑制试验（HI）在血凝板的1~11孔加入25μl生理盐水，最后一孔（12孔）加50μl。第1孔加待检血清25μl，混匀后吸25μl至第2孔，倍比稀释直至第10孔，混匀后弃25μl。11.12孔不加从1~11孔，每空加稀释好的25μl4个血凝单位（稀释倍数=血凝效价/4）的病毒悬液，37℃静置静置15-20min。（12孔不加）如果血凝价为1:28,那么4个血凝单位就是1