酶对皮肤角质细胞分离和传代的影响.pdf

ls卷1期生物工程学报Vr“f8N¨l

2002年1月ChineseJournal2()r)2

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胰酶对皮肤角质细胞分离和传代的影响

欧阳安力周燕华平谭文松’

华东理丁大学生物／J．J,；Z器1=稃同家重点实验亨．上海200237

摘要考察不同的胰酶浓度及其作用时问对角压细胞分离和传代的影响。实验发现在胰酶讹度o25％时作用

uJ

5rain可获得的总活细胞量和有克麾形成能力的细胞量均优于其它培养条件；而在胰酶浓度005％时作用5rain

获得最大的原代角质细胞贴壁率。随着胰酶浓度的提高，传代角质细胞的贴壁卒和贴壁速率常数以及克降形成缸

均随之增加，因此在传代培养时使用0．25％胰酶浓度进行消化较为适宜，

关键词角质细胞，胰酶，贴壁率，克隆形成率

中圈分类号R739．6文献标识码A文章编号1000．306l(2002)0l一()059—04

大面积烧伤病人及皮肤病患者的临床治疗对皮织加入到200u／mL的中性蛋白酶(SIGMA)中，4气下

肤组织的需求一直很大，但f鼯床E能够获得的供体消化18h，使真皮和表皮分离、然后将表皮剪碎，用

皮肤组织十分有限．1975年Green等人首先培养成0．05％、0．1％、0．15％、025％的胰酶(SIGMA)，

功人工皮肤组织‘。，并成功地用于皮肤缺损患者的0．02％EDTA共6rnL(胰酶／EDTA消化液的体积大约

治疗。3．成为烧伤治疗领域里的～个里程碑。现为被消化组织体积的3倍)作用5rain、10rain、15rain、

在已有公司开发出了商品化的皮肤“’，这些皮肤都25rain，并用等量的小牛血清中和胰酶活性。150目

是由皮肤细胞和不同的基质材料构成，构成皮肤组筛嘲过滤，除去皮肤碎块。2000r／rain离心5rain．倒

织时需要大量的成纤维细胞和角质细胞等种子细去I清，PBS清洗2遍．加入含200u／mL庆大霉素的

胞，所以皮肤种子细胞的培养是当前皮肤组织j：程限制性角质细胞无血清培养基(GIBCO)，细胞接种

中·个十分重要的研究课题。经过几十年的发展，量为2×locells／cm2，每个25cm2的培养瓶(NLNC)

吱纤维细胞的培养技术已经日臻完善，但角质细胞中加培养基5mL，在37℃、5％CO，的培养箱(REv．

培养仍然是一个难题，这是由角质细胞的特性所决CO)中培养，每3天换液1次。

定的：角质细胞是一种定向千细胞”1，很容易分化，1．2细胞计数和细胞活性计算

而且寿命很短”，如何从皮肤组织中获得更多的有细胞计数采用血球汁数板，并用台盼蓝染色，未

活性和克隆形成能力的角质细胞是一个呕待解决的被染成蓝色的为活细胞。细胞活性=活细胞／总细

课题，文献报道胰酶对角质细胞的分离传代有十分胞x100％。实验结果是3次相互独立实验的平均

重要的影响11“，坦文献中采用的胰酶浓度和竹：用馥。

时问并不相同1‘9。具体的胰酶浓度及其作用时间1．3贴壁率

对原代角质细胞的分离和传代角质细胞的培养有何细胞用3×105cells／mL的密度接种到48孔板

影响尚未见报道，(NUNC)中，每iL0．5mL：24h计数游离细胞，并计算

1材料和方法髓率川壁率=塑≮糕塑×100％。

1．I原代角质细胞的分离实验结果是3次相互独立实验的平均值．

取新生ld的sd小鼠皮肤，剪成1c秆左右的皮另外假定角质细胞的贴壁过程符台一级动力学