目的基因的制备 (2).ppt

******************************************************************************************************③合成cDNA第二条链a.自身引导合成法b.大肠杆菌RNaseH酶降解取代法c.oligo(dG)寡聚引物引导法d.PCR法第63页,共83页，星期六，2024年，6月a.自身引导合成法：原理：单链cDNA的3’端能够形成发夹状的结构作为引物，在大肠杆菌聚合酶I、Klenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链。缺点：S1核酸酶切割发夹状结构会丢失对应于mRNA5’端的序列。S1核酸酶偶尔破坏合成的双链cDNA分子。第64页,共83页，星期六，2024年，6月b.大肠杆菌RNaseH酶降解取代法-置换合成法原理：以第一链合成产物cDNA-mRNA作为切口平移的模板，RNA酶H对mRNA造成切口和缺口，产生一系列RNA引物，大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链。第65页,共83页，星期六，2024年，6月优点：a）合成cDNA的效率高b）直接利用第一链的反应产物，不需纯化c）避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA第66页,共83页，星期六，2024年，6月c.oligo(dG)寡聚引物引导法oligo(dG)作为引物可与cDNA第一链3’末端的poly(C)序列相结合，有效的引发cDNA第二链的合成。第67页,共83页，星期六，2024年，6月d.RCR法以cDNA的第一条链为模板设计引物。优点：可获得多拷贝的双链cDNA;不用纯化mRNA;同聚物尾巴保护末端.第68页,共83页，星期六，2024年，6月4.2.2cDNA基因文库的构建主要步骤：①从生物体或细胞中提取mRNA；②利用逆转录酶合成cDNA的第一条链；③利用DNA聚合酶，以cDNA第一条链作为模板，用适当引物合成cDNA第二条链，④cDNA与载体的重组后导入大肠杆菌宿主细胞增值。第69页,共83页，星期六，2024年，6月④cDNA与载体的重组后导入大肠杆菌宿主细胞增值。cDNA末端的处理由于大片段的平末端连接效率非常低，因此为了避免用平末端与载体连接，对双链cDNA的末端进行加工.方法：添加特异性接头以形成适合于克隆的黏性末端第70页,共83页，星期六，2024年，6月方法：在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶第71页,共83页，星期六，2024年，6月第72页,共83页，星期六，2024年，6月第73页,共83页，星期六，2024年，6月第74页,共83页，星期六，2024年，6月4.2cDNA基因文库的构建及目的基因分离4.2.1cDNA基因文库的概念4.2.2cDNA基因文库的构建4.2.3mRNA丰度和cDNA基因文库大小4.2.4cDNA克隆的优越性第75页,共83页，星期六，2024年，6月4.2.3mRNA丰度和cDNA基因文库大小的关系某种mRNA在不同组织不同发育时期的丰度不同。cDNA文库中储存某种基因的概率与总mRNA中这种基因的mRNA的拷贝数有关。某种mRNA的拷贝数越多，意味着cDNA文库中储存该基因的概率越大，越容易分离出来。第76页,共83页，星期六，2024年，6月mRNA的丰度与文库克隆子数的关系N=ln(1-P)/ln(1-f)N:所需克隆数;P:要求的概率;（99%）f:一种mRNA的丰度与总mRNA的比值第77页,共83页，星期六，2024年，6月4.2cDNA基因文库的构建及目的基因分离4.2.1cDNA基因文库的概念4.2.2cDNA基因文库的构建4.2.3mRNA丰度与cDNA基因文库大小的关系4.2.4cDNA克隆的优越性第78页,共83页，星期六，2024年，6月4.2.4cDNA克隆的优越性①cDNA文