蛋白质定性定量分析.pptx

关于蛋白质的定性定量分析

第一张，PPT共五十九页，创作于2022年6月

蛋白质定性分析(qualitativeanalysis)

确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是何种蛋白质

蛋白质定量分析(quantitativeanalysis)

确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白成

分的含量

第二张，PPT共五十九页，创作于2022年6月

蛋白质含量的测定方法(重点掌握)

蛋白质相对分子量测定(SDS)

等电聚焦电泳(IEF)(一般了解)

蛋白质的免疫印迹分析(westernblot)

第三张，PPT共五十九页，创作于2022年6月

第一章蛋白质的含量测定

蛋白质的含量测定

基于蛋白质的

光吸收特性

基于蛋白质的

化学显色反应

基于蛋白质的

元素组成特点

第四张，PPT共五十九页，创作于2022年6月

蛋白质元素组成的特点

各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16%由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此

只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据

以下公式推算出蛋白质的大致含量：

100克样品中蛋白质的含量(g%)

=每克样品含氮克数×6.25×100

第五张，PPT共五十九页，创作于2022年6月

这一方法可用来快速检测溶液中是否含有

蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋

白质的洗脱峰

第六张，PPT共五十九页，创作于2022年6月

一、紫外光谱(A280)吸收法

原理

色氨酸、酪氨酸的最大

吸收峰在280nm附近

大多数蛋白质含有这两种

氨基酸残基，所以测定蛋白

质溶液280nm的光吸收值是

分析溶液中蛋白质含量的快速

简便的方法波长(nm)

芳香族氨基酸的紫外吸收

第七张，PPT共五十九页，创作于2022年6月

光密度

优点·快速

·对蛋白质无破坏性

缺点·不是严格的定量，适用于测定蛋白质粗提液

·核酸可引起强干扰作用

·芳香族氨基酸含量差异可以起

误差

第八张，PPT共五十九页，创作于2022年6月

计算方法·标准曲线法

·蛋白质浓度(mg/ml)=1.45×A₂80-0.74×A260

注意事项·石英比色杯

·调零所用溶液

·配制标准蛋白所用溶液·光密度范围

第九张，PPT共五十九页，创作于2022年6月

这是一种迅速、可靠的通过染色法测定

溶液中蛋白质含量的方法

第十张，PPT共五十九页，创作于2022年6月

二、考马斯亮蓝G-250检测法

原理

该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物在595mn波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测595mn的光吸收值大小计算蛋白的含量

第十一张，PPT共五十九页，创作于2022年6月

所需时间·10min

优点·快速(反应时间仅需2min)

·敏感，几乎没有蛋白质损失

缺点·对各种纯化蛋白质反应不同

·用这种测定方法对蛋白质引起不

可逆的变性

第十二张，PPT共五十九页，创作于2022年6月

计算方法·标准曲线法

注意事项·反应10～15min后开始出现沉淀，尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条件下易发生沉淀

·若选用目的蛋白来做标准曲线或用另一种方法来校正，所测蛋白浓度较准确

第十三张，PPT共五十九页，创作于2022年6月

三、Lowry检测法

这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已得到广泛应用.

第十四张，PPT共五十九页，创作于2022年6月

原理

首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这

一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin-酚试剂),

产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色

的复合物在745～750nm处有最大的吸收峰，颜色

的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比，可根据750nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量

第十五张，PPT共五十九页，创作于2022年6月

优点·一种可靠的蛋白质定量方法

·不同蛋白质之间差别很小

缺点·干扰物质多

·某些试剂不稳定

·使蛋白质发生不可逆变性

第十六张，PPT共五十九页，创作于2022年6月

计算方法·标准曲线法

注意事项·在加入试剂30min后呈色达到饱

和，时间延长颜色信号减弱

·许多干扰物质降低颜色反应

·高盐浓度可引起沉淀

第十七张，PPT共五十九页，创作于2022年6月

这是近年来新研制的一种改进的Lowry测定法

第十八张，PPT共五十九页，创作于202