分子诊断学之核酸扩增技术-聚合酶链反应技术.pptxVIP

1一、聚合酶链反应技术

polymerasechainreaction，PCR（一）PCR技术发展简史（二）PCR技术原理（三）PCR反应体系、条件及其优化（四）扩增产物检测及分析（五）PCR常见问题与原因分析（六）PCR衍生技术

2聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。概念

31953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋结构及半保留复制模型。1958年，Meselson和Stahl用实验证实DNA半保留复制模型。70年代以来，人们采用两种思路去尝试建立基因的无性繁殖体系，一是基因克隆技术，二是体外扩增技术。（一）PCR技术发展简史

41971年，Khorana（美国MIT教授，1968年诺贝尔医学奖得主）：“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。”核酸体外扩增最早设想被遗忘原因：（1）很难进行测序和合成寡核苷酸引物；（2）1970年Smith等发现了II型限制性内切酶，体外克隆基因已成为可能。

51976年，台籍科学家钱嘉韵（AliceChien）从黄石国家公园的嗜热菌Thermusaquaticus中分离出热稳定的TaqDNA聚合酶。1985年，美国Cetus公司人类遗传研究室的KaryMullis发明PCR反应，Saiki等首次应用PCR法成功地扩增了人?-珠蛋白的DNA，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。

6inventedbyKarryB.Mullis(1983,NobelPrize1993) patentsoldbyCetuscorp.toLaRochefor$300milliondependsonthermo-resistantDNApolymerase(e.g.Taqpolymerase)andathermalcycler

71988年Saiki开始将耐热性TaqDNA聚合酶应用于PCR，整个反应只加一次酶即可，扩增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。1989年被誉为“分子年”，列PCR为十余项发明之首。1993年，Mullis荣获诺贝尔化学奖。

8（二）PCR的基本原理试管中进行的DNA复制反应，依据DNA半保留复制的机理；体外DNA分子于不同温度下可变性/复性；通过人为控制体外合成系统的温度，使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。

91）变性，加热至95℃，使模板DNA解开成单链；2）退火，温度降至适宜，使引物与模板互补结合；3）延伸，温度升至72℃，DNA聚合酶以4种dNTP为底物，在引物的3’-OH上，合成与模板互补的DNA新链。加热变性复性复温

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11PCR循环–第一步–高温变性

12Tm值Tm即溶解温度（meltingtempreture），也叫解链温度。是指当双链解链到A260最大值的一半时的温度。它的高低由DNA分子中G、C含量的百分比决定。

13PCR循环–第二步–引物与靶序列退火

14Basepairingduringrenaturation

15PCR循环-第三步-引物延伸

16第1个PCR循环完成后–

得到两个拷贝的靶序列

1730次循环后靶序列扩增的数量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,824

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20理论扩增率：2n递增（n为循环次数），25～30循环，目标DNA可增加109倍。实际扩增率：(１＋Ｘ)n，X为PCR的实际扩增率，平均约为75%。由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以实际上进行30个循环后，扩增倍数一般可达106～107。以上“变性、退火、延伸”三部曲为PCR一轮循环。

21反应体系模板（DNA或RNA）引物TaqDNA聚合酶10×PCR缓冲液1.5～4mMMg2+0.2mMdNTP反应流程预变性变性退火延伸延伸完全终止25～35循环（三）PCR反应体系、条件及其优化

22模板DNA引物TaqDNA聚合酶4种dNTP含Mg2+的缓冲液。PCR的反应体系

23PCR反应条件变性95?C延伸72?C退火Tm