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2.2.6蛋白的纯化
A、包涵体的分离与纯化
①包涵体的制备：诱导1L的菌液，离心收集菌体，lysisbuffer重悬菌体，
-80℃反复冻融三次，冰浴条件下超声波破碎菌体，功率200W，超8s，
停8s，工作70次。
②裂解后菌液12000rpm离心30min，收集沉淀。用PBS洗2次。
③包涵体洗涤：将沉淀分别用含1、2、3、4mol/L尿素的包涵体洗涤液洗
涤包涵体，SDS分析包涵体洗涤后的纯度，摸索最佳包涵体洗涤
条件。
④包涵体溶解：用含8mol/L尿素的BufferA溶解包涵体，室温轻轻搅拌
作用1-2h，4℃12000rpm离心30min，取上清。
⑤透析袋的处理：50%乙醇水浴1h，用50%乙醇，10mmol/LNaHCO3，1
mmol/LEDTA和双蒸水各泡洗两次。
⑥包涵体的复性：将包涵体用含8mol/L尿素的BufferA溶解后，12000rpm
离心30min，上清装入处理好的透析袋中，在4℃进行透析48h，并用
磁力搅拌器搅拌，逐渐降低复性缓冲液中尿素的浓度，从6mol/L—4
mol/L—2mol/L—0mol/L，开始几次每隔3-4h换一次透析液，后面可
以间隔12小时换透析液。
⑦透析结束后，用PEG20000浓缩蛋白，-80℃备用。
B、可溶性蛋白的纯化
诱导1L菌液，6000rpm离心10min收集菌体，lysisbuffer重悬菌体，-80℃
反复冻融2-3次，超声裂解菌体。12000rpm，离心30min，收集上清，上清样
品用0.45μm的滤膜过滤一次，用QIAGEN公司的Ni-NTA亲和层析柱纯化可溶
[65]
性蛋白。
①用5倍体积的pH8.0lysisbuffer平衡树脂。
②将可溶性表达的蛋白上柱，（上柱前调样品pH值至8.0），调整流速为0.5
ml/min.，收集穿透液用于之后的SDS检测。
③缓慢加入4ml的washbuffer洗去未结合的蛋白和杂蛋白，洗两次，流速
为0.5ml/min。
④每次用1ml的Elutebuffer洗脱目的蛋白，洗脱10-12次。
⑤透析除去咪唑，浓缩蛋白后用于免疫小鼠。
2.8重组蛋白的纯化与复性
2.8.1包涵体的纯化
本实验中，重组蛋白主要以包涵体的形式得到表达。
构建重组原核表达质粒的策略中，重组蛋白应融合上pET-32a载体上带有的
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多聚组氨酸(6×His)标签，因此，可以利用Ni金属螯合亲和层析法纯化重组蛋
白。本实验所采用的纯化介质为Ni-NTA树脂(Qiagen)，纯化中涉及的溶液配制
和操作方法均参照Ni-NTA树脂使用说明书。
2.8.1.1蛋白纯化缓冲液配制：
1)bufferB：100mMNaHPO、10mMTris、8MUrea(尿素)，用NaOH调
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pH值至8.0；
2)bufferC：配制同bufferB，用HCl调节pH值至6.3；
3)bufferD：配制同bufferB，用HCl调节pH值至5.9；
4)bufferE：配制同bufferB，用HCl调节pH值至4.5；
2.8.1.2Ni-NTA树脂再生试剂：
1)剥离buffer：6MGuHCl、0.2M醋酸；
2)洗涤剂：2%(m/V)SDS；
3)蛋白洗脱液：100mMEDTA；
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4)Ni补充试剂：100mMNiSO；
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