大肠杆菌蛋白提取方法.docx

大肠杆菌周质蛋白提取

提取胞周质蛋白，渗透压破壁的方法是经典也好用的办法。

步骤如下：

1、离心收集菌体，8000rpm/3~5min；

2、PBS重悬菌体，洗涤2次，离心条件同上；

3、30%蔗糖（1克菌体至少20ml）重悬菌体，放置10分钟；

4、离心收集菌体，离心条件同上；

5、纯水重悬菌体（1克菌体至少20ml），放置10分钟；

6、离心，条件同上，小心移出上清即为提取液；如果不清亮，再15000rpm/10min离心一次。

注意事项：蔗糖和水悬浮时间长，则可能菌体全部破碎；而时间短了，则可能提取不完全。同理，离心力太大离心时间长，可能造成菌体完全破碎。

上面说的条件，是指台式小离心机，如果处理的样品多，使用大的转头或连续流转头，则适当考虑离心力的换算，同时考虑加速/减速比较慢而适当调整离心时间。

提取液测定260/280吸收值，再走电泳，应该能够初步判断提取的效果。260很高、杂蛋白很多，则破菌过分了。

1.以冰冻的20%蔗糖、2.5mMEDTA、20mMTris-HCl(pH8.0)重溶诱导细胞，浓度达到5OD550单位/ml，冰浴10分钟。

2.15000g离心30秒，取出沉淀再重溶于同样体积的冰冻的2.5mMEDTA，20mMTris-HCl，pH8.0。冰上静置10分钟。注意EDTA不与His?Bind?树脂相匹配。

3.15000g离心10分钟。上清液为渗透休克组分。用SDS分析上清和沉淀。

我刚试过这个方法，效果很好，我表达的是约9.5KD的多肽。

1.是将冰冻的20%蔗糖,2.5mMEDTA，20mMTris-Hcl(pH8.0）直接加入诱导培养的菌液中吗？

还是将菌液离心收集沉淀，将沉淀用上述溶液重溶？

12000rpm30s离心菌液，沉淀用高渗液重悬，冰上放10min，12000rpm30s再次离心，沉淀用低渗液重悬，冰上放置10min，并不时颠倒混匀，以利于目的蛋白的释放。（我没有颠倒混匀好像效果也不错，或许这样做效果会更好吧）

2.对于方法中提到的浓度达到5OD550/ml，是指加入溶液后的菌液浓度吗？

书上查到的资料是550nmOD值为5，是第一问重悬后浓度。这个浓度我想不要紧的，我取1ml菌液，沉淀用1.5ml高渗液重悬，OD值仅为0.6，所以我实际操作时按1ml菌液沉淀用0.5ml高渗液重悬。比较最后制得的上清和菌体沉淀目的蛋白含量，上清中含量远高于菌体。

细胞质蛋白提取