吉林农业大学 动物微生物学课件43.ppt

****/28明德崇智厚朴笃行病毒的检测第1节病毒的分离与鉴定第2节病毒感染单位的测定第3节病毒颗粒的检测第4节病毒的血清学检测第5节病毒核酸的检测第1节病毒的分离与鉴定病毒分离鉴定的一般步骤采集标本接种杀灭杂菌(青、链霉素，有时用抑制霉菌的药物，如制霉菌素)出现病状易感的动物鸡胚病变或死亡细胞培养细胞病变鉴定病毒种型(显微镜、血清学、核酸检测、理化学特征方法)一、标本采集与处理1、采集原则：疾病不同采集部位不同，选病毒含量最高的组织。发病或死亡动物组织、分泌物或排泄物。（1）腹泻：肠内容物、粪便、肠系膜淋巴结。（2）口蹄疫：水疱液或水疱皮。（3）病毒血症：白细胞等。2、病料的处理（1）器官或组织样本：肺脏、脑、肝、脾、淋巴结等，取小块充分研磨，加入含青、链霉素的Hank’s液，离心取上清液。（2）分泌物或排泄物：鼻液、脓汁、乳液汁等分泌物或渗出液、粪便，应加入高浓度的抗生素，充分混匀后，置4℃冰箱内处理2~4小时或过夜，离心后取上清作接种用；（3）咽喉拭子：迅速将其浸泡入含有2%犊牛血清和一定浓度的青、链霉素的Hank’s液中，充分涮洗棉拭子，反复冻融3~5次，离心后取上清液。（1）细胞的选择：原代本动物细胞对病毒敏感性高。传代细胞方便。（2）细胞接种方法单层接种：37℃吸附30-60分钟。同步接种：分离细小病毒等需要细胞有丝分裂细胞。（3）注意事项：处理的病料需做一定倍数稀释，每个稀释度均需接种细胞。盲传三代，无CPE或用其他方法证明阴性，弃去，报告阴性结果。二、分离病毒1、细胞分离病毒2、禽胚分离病毒三、病毒理化特性鉴定1、鉴定项目：病毒核酸型鉴定、耐酸性试验、脂溶剂敏感性试验、耐热性试验、胰蛋白酶敏感试验等。2、鉴定用载体：细胞、鸡胚、动物，应设立已知病毒为对照。3、指标：TCID50、LD50、ID50、ELD50、EID50等。一、概述1、病毒滴度的概念：测定样本中病毒的浓度，即病毒的滴度。2、病毒滴度测定方法：用系列稀释的病毒接种细胞、鸡胚或实验动物，检测病毒增殖的情况。常用于病毒滴度测定的技术有空斑试验、终点稀释法、荧光-斑点试验、转化试验等，最常用的是前二者。二、空斑试验空斑试验是一种可靠的病毒滴度测定的方法。根据样本的稀释度和空斑数，计算每毫升空斑形成单位（PFU），即可确定病毒的滴度。第2节感染单位的测定1、概念：将病毒作系列稀释，选择4~6个稀释度，接种一定数量的细胞、鸡胚或动物，每个稀释度作3-6个重复。2、病毒滴度表示方法（1）细胞培养：可通过CPE来判定组织培养半数感染量（TCID50）。（2）禽胚：计算鸡胚半数致死量（ELD50）或鸡胚半数感染量（EID50）。（3）动物，是以死亡或发病来测定，计算半数感染量（ID50）；以体温反应作指标时，可计算半数反应量（RD50）。三、终点稀释法由表可见，CDV疫苗株在Vero细胞上增殖的TCID50介于10-4和10-5之间。按Reed－Muench公式计算：高于50%的百分数－50/高于50%的百分数－低于50%的百分数＝80－50/80－20＝0.5即CDV疫苗株在Vero细胞上的TCID50为10-4.5/0.1mL。病毒液稀释度细胞孔观察结果累计细胞孔数CPE+所占比例CPE+孔所占的%CPE+CPE-CPE+CPE-10-110-210-310-410-510-610-710-84040403113040404160120804＋1140801201616/1612/128/84/51/50/80/120/161001001008020000CDV疫苗株在Vero细胞上增殖的TCID50第3节病毒颗粒的检测一、电子显微镜技术透射电子显微镜扫描电子显微镜1.正染法：超薄切片法取材固定戊二醛四氧化锇清洗与脱水浸透包埋聚合切片染色铀染铅染超薄切片法的优缺点：优点：可观察病毒形态和形态发生过程缺点：操作复杂，费时，但标本可长时间保存（1）原理：负染是指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外周的电子密度，使样品显示负的反差，衬托