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人血清白蛋白诱导人肾小管上皮细胞对Egr—1表达的影响

目的：探讨人血清白蛋白对人肾小管上皮细胞Egr-1表达的影响。方法：

将人肾小管细胞培养至90%～98%融合时随机分为A、B、C、D四组，其中，A

组为正常组，B、C、D组为药物组，并分别给予不同浓度（0、10、20、40mg/mL）

的人血清白蛋白共培养，各组分别于24、48、72h收集细胞，并应用免疫印迹

检测Egr-1表达水平。结果：与A组比较，各时间段Egr-1表达均有不同程度升

高，其中24hD组Egr-1蛋白相对表达、48及72hC、D组Egr-1蛋白相对表达

均显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05），其他药物组差异均无统计学意义

（P0.05）。结论：人血清白蛋白刺激可呈剂量和时间依赖性上调人肾小管细胞

表达Egr-1。

终末期肾衰竭是各种慢性肾脏病的晚期，而肾间质纤维化（Renalinterstitial

fibrosis，RIF）是所有慢性肾脏疾病进展至终末期肾病的共同途径。蛋白尿是多

种肾脏疾病常见的症状，是肾小球疾病中最常见的临床表现之一，其不仅反映肾

小球损伤的程度，且大量实验研究表明，蛋白尿是慢性肾病进展的独立致病因素

[1]。研究发现，尿蛋白的主要成分是白蛋白，对近端肾小管上皮细胞存在直接

损害作用，白蛋白过度重吸收与肾小管上皮细胞增殖、凋亡失衡以及表型转分化

等有密切关系[2]。因此，蛋白尿是公认的能反映多种肾脏病预后的因素，也是

引起小管间质损伤及肾脏疾病的重要因素。早期生长反应因子（Earlygrowth

responsegene-1，Egr-1）能被低氧、缺血、多肽生长因子及尿素等多种刺激因素

诱导，并能调控下游多种基因的表达，参与细胞的生长、分化、增殖和凋亡[3]。

Egr-1可通过促进转化生长因子-β（TGF-β）表达，细胞外基质（ECM）积聚进

一步参与肾纤维化[4-5]。本研究拟观察人血清白蛋白超载人肾小管上皮细胞

（HK-2）对Egr-1表达的影响，以进一步探讨白蛋白对HK-2的损害机制。

1材料与方法

1.1材料人肾小管上皮细胞购自广州凯基，胎牛血清（Gibco公司），

RPMI-1640培养基（Gibco公司），人血清白蛋白（纯度98%、Sigma公司），小

鼠抗人Egr-1单克隆抗体（Abcam：产品编号ab55160），SDS电泳凝胶试剂盒、

BCA蛋白检测盒、ECL化学发光底物、羊抗小鼠二抗（均购自武汉博士德），脱

脂奶粉（购自Sigma，美国）。1.2主要仪器SW-CJ-2F（标准型）双人双面垂直

工作台；二氧化碳培养箱（HF90）；台式高速冷冻离心机（D37520）ThermoFisher，

德国；DY-CZ-24D型电泳槽，北京市六一仪器厂；DYY-2C型电泳仪，北京六一

仪器厂；半干转印仪，美国BIO-RAD。

1.3方法

1.3.1细胞培养及分组将HK-2细胞于含10%胎牛血清1640培养基、培养

条件5%CO2，37℃培养。每2～3天换液1次，每3～5天传代1次。镜下观

察细胞生长至90%～95%融合时，用0.25%胰酶消化后，待镜下观察细胞间隙增

大后移除胰酶加入含10%胎牛血清1640培养液终止消化，按1∶2～1∶3传代。

待细胞长至90%～95%融合时，用无血清培养基同步化24h。细胞随机分为A、

B、C、D四组并分别给予不同浓度的人血清白蛋白培养，A组浓度为0mg/mL、

B组浓度为10mg/mL、C组浓度为20mg/mL、D组浓度为40mg/mL，实验分

别观察24、48和72h。

1.3.2观察指标及方法免疫印迹检测Egr-1的表达：HK-2细胞经药物处理

后分别于24、48和72h收集细胞，用4℃预冷的PBS漂洗3次，加入100μL

细胞裂解液（每1mL裂解液内含10μL蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min后刮

下细胞，收集于1.5mLEP管中，于4℃、12000r/min离心15min后，取上清

液，BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性后于10%聚丙烯酰胺凝胶中

电泳分离，电泳完毕后用BIO-RAD半干转印仪将蛋白转移至0.45μmNC膜上。

5%