transwell实验原理与步骤.docVIP

一、Traｎswell小室制备

1、?无基质胶Traｎswell小室制备

①包被基底膜：?用5０mg/LＭaｔriｇｅｌ1:8稀释液包被Ｔransｗeｌl小室底部膜得上室面,4℃风干。如果需要在下室面铺FＮ得话,可将2０0uｌ枪头得尖端剪掉,吸取ＦＮ均匀涂抹在小室得下面。用胶原（ｃollagen)得话,一般配成0、5mg/ml,直接用枪吸了涂在膜上。?②水化基底膜：?吸出培养板中残余液体,每孔加入5０ｕl含10g/LＢSA得无血清培养液，37℃,３0miｎ。另有tｉaｎjin_gｌioma战友提供得方法:在上室得聚碳酸酯膜上加入稀释后得Maｔrigel（３、9ug／uｌ)60-80μl(注意体积不可太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好),置３7℃30miｎ使Matriｇｅl聚合成凝胶。?2、?有基质胶得Transｗeｌl小室制备??Ｃｈemiｃoｎ公司得ＥCM５50系列说明书要求,将小室放入培养板中,在上室加入３00μl预温得无血清培养基，室温下静置15-30ｍｉｎ,使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。

二、制备细胞悬液

①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿１2-24h，进一步去除血清得影响。但这一步并不就是必须得。?②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液，用PＢS洗1-２遍,用含ＢＳA得无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×1０5,个人认为不要超过5×1０5。具体实验时采用密度要自己摸索,因为不同细胞,其侵袭能力就是不同得。个人经验,细胞量过多,穿过膜得细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果得话将难以计数;而过少得话,可能还没到检测得时间点,所有得细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样得时候,上室内还要有一定量得细胞存在。个人认为,对照组与处理尽量不要分开计数，因为细胞数目得差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数,那么计数一定要多重复几次,力求准确,尽量保证对照组与处理组细胞密度一致。

三、接种细胞

①取细胞悬液100－200μl加入Ｔｒanswell小室,不同公司得、不同大小得Ｔrａnswell小室对细胞悬液量有不同要求,请参考说明书。24孔板小室一般200μl。?②2４孔板下室一般加入５00μl含FBS或趋化因子得培养基,不同得培养板加得量有不同要求,具体请参考说明书。这里要特别注意得就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液得趋化作用就减弱甚至消失了,在种板得时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

③培养细胞:常规培养1２－48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。时间点得选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目得影响也不可忽视。?以我得课题为例，我使用得药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力,还对细胞增殖有明显抑制。我选择得药物浓度就是用MTＴ筛选出得72h得ＩＣ５0。用这个浓度处理细胞，２4h内对细胞增殖并无明显抑制,但24h后，抑制作用就开始出现了。所以,用这个浓度来做Ｔranswell,处理时间也必须限定在24h内,否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组,那么就难以肯定穿过膜得细胞比对照组少,究竟就是由于侵袭被抑制引起,还就是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起得了。

时间过长不可以,同样,过短也不行，因为细胞内会有一定量得MMPｓ储存,短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去,进而发挥作用,影响MＭPs表达,到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点得选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应,但前提就是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外,我瞧到细胞在小室内得形态不就是正常培养贴壁得形态,而就是圆形得,仍就是悬浮时得形态,不过会聚集成团,所以瞧到细胞不正常贴壁也不要紧张,就是正常现象?在培养过程中,膜下会逐渐有少量小气泡产生,这就是正常现象,可不予处理,但我遇到过培养一段时间后,膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此,个人建议,最好接种细胞后１－２h把培养板从培养箱里拿出来瞧瞧,确信没有大气泡产生。??四、结果统计

检测穿过得细胞数有两种方法:

1、?直接计数法?（1)“贴壁”细胞计数

这里所谓得“贴壁”就是指细胞穿过膜后，可以附着在膜得下室侧而不会掉到下室里面去。?通过给细胞染色，可在镜下计数细胞

①用棉签擦去基质胶与上室内得细胞

②染色:常用得染色方法有结晶紫染色、台?蓝染色、Gieｍｓａ染色、苏木精染色、伊红染色等。个人推荐采用０、1%结晶紫染色,这种方法有如下优势:(１)、不需要固定细胞，直接染色即可。（2）、配制简单方便。(３)、染色后可以用33%醋酸脱色,将结晶紫完