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GST-Smad4融合蛋白的表达与纯化

梅竹;杨予涛;徐志卿

【摘要】旨在原核表达Smad4基因,纯化获得GST-Smad4融合蛋白.以人表皮

HaCaT细胞的cDNA为模板,利用PCR扩增含有BamHI和Sal酶切位点的

Smad4基因；然后将其克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中,将正确的重组载体转

入大肠杆菌BL21(DE3)；用IPTG诱导表达,再利用MagneGSTparticles亲和纯

化GST-Smad4融合蛋白；最后通过Westernblot鉴定此融合蛋白.结果显示,成

功构建pGEX-4T-1-Smad4原核表达载体；30℃条件下,0.2mmol/L的IPTG能

诱导出大量的可溶性GST-Smad4蛋白；经MagneGSTparticles纯化的GST-

Smad4蛋白可被Smad4的抗体特异识别.纯化的GST-Smad4蛋白可用于后续的

生物学研究.

【期刊名称】《生物技术通报》

【年(卷),期】2013(000)001

【总页数】5页(P134-138)

【关键词】Smad4;原核表达;蛋白纯化

【作者】梅竹;杨予涛;徐志卿

【作者单位】首都医科大学基础医学院,北京100069;首都医科大学基础医学院,北

京100069;首都医科大学基础医学院,北京100069

【正文语种】中文

转化生长因子-β（TGF-β），是一种具有多种生物学活性的多肽类细胞因子，由多

种组织细胞合成，调控细胞周期，影响细胞的增殖、分化、黏附、转移和凋亡，与

肿瘤的发生、发展和转归密切相关［13］。TGF-β信号通路主要由TGF-β与其相

应的受体和细胞内信号转导分子组成。TGF-β信号通路的胞内转导分子主要由

Smads蛋白构成。Smads蛋白主要由受体激活的Smads（R-Smad）、通用型

Smads（Co-Smad）和抑制型Smads（I-Smad）构成。受体激活的Smads主

要包括Smad2和Smad3，通用型Smads只包括Smad4，抑制型Smads包括

Smad6和Smad7。

Smad4基因共有11个外显子，10个内含子，其转录子长2680bp，编码由

552个氨基酸组成的蛋白质，主要由MH1结构域、MH2结构域和连接区所组成。

MH1结构域具有序列特异的DNA结合能力，MH2结构域是形成同/异源聚合物

的结合位，同时还具有转录激活和核定位功能［3］。Smad4作为一种抑癌基因，

是TGF-β信号通路的重要调节因子，广泛参与细胞分化、增殖、迁移和凋亡等多

种生物学过程［4］。

当细胞被TGF-β激活后，引起R-Smads（Smad2和Smad3）的磷酸化，而磷酸

化的R-Smads从受体复合物上解离，迅速与Smad4形成异源复合物，然后被转

运进细胞后，与Smad结合元件（SBE）结合，并在其它辅助因子的协同下，调节

靶基因的表达［5］。因此，在TGF-β信号通路中，Smad4处于中枢地位。鉴于

Smad4在TGF-β信号通路中处于的关键地位，本研究拟在体外表达并纯化

Smad4蛋白，旨在分离和鉴定与Smad4相互作用的蛋白，从而进一步丰富TGF-

β信号通路的组成。

1材料与方法

1.1材料

pGEX-4T-1质粒、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21（DE3）均为本实验室保存；

高保真Taq聚合酶购于Roche公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR纯化

试剂盒购于MN公司；反转录试剂盒购于Invitrogen公司；各种限制性内切酶购

于NEB公司；Smad4抗体购于Milipore