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RhoA基因在大肠癌组织中的表达及功能的初步研究

王颢

【摘要】：小G蛋白是指分子量20~30KD的单亚基G蛋白，已发现有100多种成员。根

据其一级结构的同源性及功能将它们分为Ras,Rho,Rab,Arf,sar1和Ran六个家族，具有复杂

且重要的生物学功能。Rho即Ras相似物（Rashomologue），Rho家族在细胞骨架重组和

转录调节中发挥重要作用，而且近年来研究还发现Rho家族参与多种肿瘤的发生发展过程。

而国内尚未见Rho蛋白与肿瘤发生、发展间关系这方面的研究报道。因此，我们以大肠癌

组织和细胞株为研究对象，研究Rho家族是否参与大肠癌发生发展过程及其可能的作用机

制。第一部分RhoA基因在大肠癌组织中的表达首先我们研究了RhoA基因mRNA在大

肠癌组织中的表达。建立测定大肠癌组织RhoA基因mRNA表达的逆转录聚合酶链反应(R

T-PCR)最适条件，在半定量水平测定42例大肠癌手术标本正常粘膜组织和大肠癌组织的R

hoA基因mRNA表达的相对水平，并探讨与临床病理学指标的关系。结果发现42例大肠癌

组织中RhoA基因表达较相应正常粘膜组织表达高，配对t检验分析有非常显著意义(P0.01)。

以42例肿瘤与正常粘膜表达量的比值平均值2.02为界，将患者分为过度表达组和高表达组,

过度表达组中淋巴结转移发生率较高,肿瘤分期较晚（P0.05），在淋巴结转移数方面两组

之间差异有非常显著意义（P0.01）。同时采用了PCR-SSCP的方法检测RhoA基因中结构

改变可能影响RhoA功能的片段，结果在检测的42例大肠癌组织中均未发现异常泳动条带，

提示大肠癌组织中无RhoA基因突变。研究结果提示RhoA表达增加，而非基因突变在大肠

癌发生发展中发生作用。第二部分构建稳定转染RhoA-DN的人大肠癌细胞株LoVo-DN

显性失活突变体RhoA（T19N）（下文简称RhoA-DN,Dominantnegative）是第WP=819

位氨基酸从苏氨酸突变为天冬酰胺的RhoA蛋白，这种蛋白能影响野生型RhoA和鸟苷酸交

换因子(GEF)发生作用，从而抑制细胞中野生型RhoA功能。为了在细胞水平进一步探讨Rh

oA基因在人大肠癌发生发展中的可能作用及其机制，我们将RhoA-DN稳定转染至人大肠

癌细胞株LoVo，以研究RhoA蛋白的功能。首先将编码RhoA-DN和增强型绿色荧光蛋白

（EGFP）的序列插入真核表达载体pcDNA3构建pcDNA3-RhoA-DN载体。经酶切及测序

鉴定后用脂质体转染技术将pcDNA3-RhoA-DN载体转染至人大肠癌细胞株LoVo，然后用G

418筛选稳定转染的细胞株并命名为LoVo-DN。此外，将pcDNA3空载体转染至人大肠癌

细胞株LoVo并筛选稳定转染的细胞株并命名为LoVo-PC，以作为空白对照。进一步研究发

现LoVo-DN中有外源性的突变体RhoA-DNmRNA表达。而且，LoVo-DN细胞株在荧光显

微镜下可见到绿色荧光，表明我们已经成功构建了稳定转染有RhoA-DN突变体的人大肠癌

细胞株LoVo-DN。第三部分抑制RhoA蛋白活性对人大肠癌细胞株LoVo生物活性的影

响及其机制的初步研究在实验中可观察到稳定转染RhoA-DN抑制细胞内源性RhoA蛋白

活性后，LoVo-DN细胞发生形态改变，由梭形或纺锤形变为多边形或圆形。同时发现细胞

生长缓慢。因此进行细胞增殖实验并绘制生长曲线，发现LoVo-DN细胞的体外增殖速度较

对照明显减慢。将LoVo、LoVo-PC和LoVo-DN肿瘤细胞接种T淋巴细胞缺陷型裸鼠，建

立大肠癌动物模型，发现LoVo-DN细胞的体内增殖亦明显减慢（P0.01）。通过流式细胞技

术(FCM)分析细胞周期发现LoVo-DN细胞