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乙肝病毒Ｘ基因真核表达质粒及细胞模型的建立
摘要：采用聚合酶链反应(PCR)方法扩增HBVX基因，定向亚克隆入真
核表达载体pRc/CMV2，构建重组质粒pCMV/X；采用脂质体法转染QSC7701
细胞，筛选阳性细胞克隆；RT-PCR法检测HBVXmRNA的表达情况，westem
blotting法鉴定HBX蛋白的表达，结果表明，构建的真核重组表达质粒pCMV/X
中包含有完整的HBVX基因片断，pCMV/X转染的QSG7701细胞中有HBVX
mRNA及HBX蛋白的稳定表达，成功建立了HBVX稳定转染的细胞系，为进
一步探讨HBX在HCC的发生发展过程中所起的作用，提供了一个有价值的细
胞模型。
关键词：HBVX蛋白：真核表达；乙型肝炎病毒：细胞模型
乙型肝炎病毒X基因(HBVX)及其编码的多功能蛋白(HBX)在乙肝相关的
肝细胞癌(HCC)发生发展中起着重要的作用。但关于HBX能否直接转化肝细胞
一直存在着争议，其原因之一可能是缺乏合适的体外模型，我们以人源性永生化
非瘤性肝细胞株OSG7701为靶细胞，将HBvX导人OSC7701细胞，建立表达
HBX蛋白的肝细胞模型，为探讨HBX在HBV相关HCC的发生发展过程中的
作用提供一个有价值的平台。
1材料与方法
1．1材料
1．1．1载体、菌株及细胞株
pGEM-TEasyVector为美国homeCa公司产品，真核表达质粒pRc/CMV2购
自Sigma公司，E.coliDH5a及人源性肝细胞株QSG7701，为本实验室保存。
1．1．2主要试剂
TaqDNA聚合酶、10mmol/LdNTP为日本Takara公司产品：血清HBV裂解
缓冲液为上海申友生物公司产品：快速连接试剂盒、限制性内切酶ApaI和Hind
Ⅲ及DNA分子量Marker均为BBI公司产品；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、无
内毒素质粒小提试剂盒、TRANSfection转染试剂盒、细胞基因组DNA提取试剂
盒均为北京TIANGEN生物技术公司产品；胎牛血清购自杭州赛乐生物公司：高
糖DMEM为美国GIBCO公司产品：G418、蛋白分子量Marker为上海生工生物
工程公司产品；Trizol为美国MRC公司产品：逆转录试剂盒为Fermentas公司产
品；鼠抗人HBX单克隆抗体为德国abcam公司产品；辣根过氧化物酶标记的羊
抗鼠IgG、硝酸纤维素膜为ProMab公司产品：蛋白质抽提试剂盒、ECL化学发
光试剂盒均为PIERCE公司产品。
1．1．3引物
针对人HBVX基因序列的PCR引物由于akara公司合成，引物源于已发表
的序列，正义5’-AAAGCTTCCATGGCTGCTCGGGGTTG-3’：反义5’-A
GGGCCCTTAGGCAGAGGTGAAAAAG-3’(正义链含有HindⅢ酶切位点和起始
密码子，反义链含ApaI酶切位点和终止密码子)，目的片断大小为481bp.人
β-actin，actin引物由北京鼎国生物公司合成，正义
5’-TAACTGGAACGGTGAAGGTG-3’：反义
5’-AGGGCACGAAGGGGCTCATCAT-3’，目的片断大小为316bp。
1．2方法
1．2．1HBVX基因的扩增与克隆
采乙肝患者静脉血(经湘雅医院感染病科实验室检测乙肝三项定量示：
HbsAg阳性，HbeAg阳性，ttbcAb
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