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原核表达及检测

原核表达及检测

摘要：本实验采⽤IPTG诱导GFP在⼤肠杆菌中的表达，表明随着时间的推移GFP的表达量越来越多。随后⽤SDS检测

蛋⽩纯化情况

关键词：原核表达SDS凝胶电泳

⼴义的原核表达，是指发⽣在原核⽣物内的基因表达。狭义的原核表达，常出现于⽣物⼯程中。是指通过基因克隆技术，将外

源⽬的基因，通过构建表达载体并导⼊表达菌株的⽅法，使其在特定原核⽣物或细胞内表达。

⼀个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株。如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化

系统或者Tag检测等等。因为只有融合体蛋⽩才具有⽣物活性，所以还要进⾏融合体/包涵体检测。选择表达系统通常要根据实

验⽬的来考虑，⽐如表达量⾼低，⽬标蛋⽩的活性，表达产物的纯化⽅法等等。

绿⾊荧光蛋⽩(greenfluorescentprotein,GFP)是238个氨基酸组成的单体蛋⽩,其分⼦量为27kDa。1974年由Morie等从海

洋⽣物⽔母中分离出来[1],并且Prasher等在1992年从⽔母Aequoreavictoria中成功克隆出了GFP的cDNA[2]。GFP作为⼀种

新的报告基因,与以往lacZ、CAT等报告基因相⽐,有很多⽆可⽐拟的优越性:GFP不具有种属依赖性,在多种原核和真核⽣物细

胞中都表达;荧光强度⾼,稳定性⾼;不需要反应底物与其他辅助因⼦,受蓝光激发产⽣绿⾊荧光,尤其适⽤于体内的即时检测;另

外GFP分⼦量⼩,易于融合,适⽤于多种转化⽅式,对受体⽆毒害,安全可靠;并且通过替换⼀些特殊氨基酸,可以使之产⽣不同颜

⾊的光,从⽽适应不同的研究需要。

SDS的原理：组成蛋⽩质的氨基酸在⼀定pH的溶液中会发⽣解离⽽带电，带电的性质和带电量的多少取决于蛋⽩质的

性质及溶液的pH值和离⼦强度。聚丙烯酰胺凝胶在催化剂过硫酸铵（简称Ap）和加速剂N,N,N’N’四甲-基⼄⼆胺（简称

TEMED）的作⽤下，聚合形成三维的⽹状结构。蛋⽩质在凝胶中受电场的作⽤⽽发⽣迁移，不同种蛋⽩在凝胶的⽹状结构中

迁移的速率不同，其速率取决于蛋⽩质所带电荷的多少和蛋⽩质的⼤⼩和形状。根据迁移速率的不同，可将不同的蛋⽩质进⾏

分离。SDS是在蛋⽩质样品中加⼊SDS和含有巯基⼄醇的样品处理液，SDS是⼀种很强的阴离⼦表⾯活性剂，它可以

断开分⼦内和分⼦间的氢键，破坏蛋⽩质分⼦的⼆级和三级结构。强还原剂巯基⼄醇可以断开⼆硫键破坏蛋⽩质的四级结构。

使蛋⽩质分⼦被解聚成肽链形成单链分⼦。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋⽩质-SDS复合物。蛋⽩质分⼦结

合SDS阴离⼦后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从⽽消除了不同种蛋⽩质之间所带净电荷的差异。蛋⽩质的

电泳迁移率主要决定于亚基的相对分⼦质量。⽽与其所带电荷的性质⽆关。

1材料与⽅法

1.1材料

1.1.1经过双酶切鉴定的阳性单克隆菌落—先前实验保存下来的

1.1.2主要试剂：Amp（100mg/ml）?IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）?30%Acr-Bis(291)?TEMED?∶溴酚蓝?LB培养基

（液体）?1×SDSloadingbuffer（配制5×SDSLoadingBuffer，⽤时稀释）?1MTris-HCl(pH6.8)

1.5MTris-Hcl(Ph8.8)10%SDS10%过硫酸铵?1×Tris-Gly电泳缓冲液（配5×Tris-Glycine电泳缓冲液，⽤时稀释）?20%的

⼄醇?PBSbuffer?50mmol/LTris-HCl?100mM醋酸钠（PH4.5）?标准蛋⽩质。

1.1.3主要仪器：超菌⼯作台、分光光度计、摇床、离⼼机、恒温加热器、漩涡器、电泳槽、记号笔、标签纸、三⾓瓶、玻璃

棒、报纸若⼲、移液枪（1000µl、200µl、20µl）及对应的枪头若⼲、离⼼管（2ml、1.5ml）、烧杯（100ml、1000ml）各

两个。

1.2⽅法

1.2.1鉴定⽬的蛋⽩是否在单克隆⼤肠杆菌中⼤量表达

1）挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700µlLB培养基，加⼊0.7µgAmp（100mg/ml），37℃200r/min摇床培养，过夜活

化。

2）按150∶⽐例（200µl），将活化的过夜培养物加⼊10mlLB液体培养基中，加⼊10µgAmp（100mg/ml），37℃200r/min摇

床扩⼤培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液的OD600在0.6-1.0（最好0.6，⼤约需3