实验七 可见光分光光度计的操作方法 .pdfVIP

可见光分光光度计的操作方法

学时：2学时

一、实验原理

利用可见光等测定物质的吸收光谱，利用此光谱对物质进行定性定量分析和

物质结构分析的方法，称为分光光度法，使用的仪器是分光光度计。分光光度计

灵敏度高，测定速度快，应用范围广，是生物化学研究中必不可少的基本手段之

一。

可见光光谱：光是电磁波，可用波长“λ”表示，电磁波谱是由不同性质的连

续波长的光谱所组成，对于生物化学来说，最重要的波长区域是可见光和紫外光。

光的波长是二个相邻的波峰之间的距离。λ=C/V其中，λ-波长；C-光速；V-频

率；单位时间要通过一个定点的波数。可见吸收光谱是由于分子中的某些基团吸

收了可见辐射光后，发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱。它是带状光谱，反

映了分子中某些基团的信息。可以用标准光图谱再结合其它手段进行定性分析。

根据朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律：A=εbc，（A为吸光度，ε为摩尔吸

光系数，b为液池厚度，c为溶液浓度）可以对溶液进行定量分析。ε越大，吸

收光的能力越强，相应的分光光度法测定的灵敏度就越高。ε值越大，说明电子

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跃迁的几率越大，通常ε=10～10：一般认为ε10为强吸收；ε=10～10为较

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强吸收；ε10为弱吸收，此时分光光度法不灵敏。通常使用分光光度计可检测

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出的最小吸收度A=0.001，所以b=1cm，ε=10时，可检测的溶液最小浓度是

-8

C=10mol/L。

二、分光光度计的基本参数和组成与构造

1.722S可见光分光光度计的基本参数

波长范围：340-1000nm

波长精度：±2nm（360-600nm）

表面刻度：（T）0-100%（A）0-2

2.组成与结构

各种型号的分光光度计不论是何种型式，基本上都是由五部分组成：（1）

光源；（2）单色器（包括产生平行光和把光引向检测器的光学系统）；（3）

样品室；（4）接受检测放大系统；（5）显示或记录器。

光源单色器样品室检测放大系统显示器

三、实验试剂

NaCl:1mol/lL、5mol/L；NaOH:1mol/lL、10mol/L；其他溶液。

四、实验步骤

1.将波长调至550nm，打开样品池盖；

2.开启电源开关，预热20min；

测定透明材料的透射比测定透明溶液的吸光度

预热

设定波长

预热

设置空白

设定波长

设置空白

置标尺为透射比“”

调100%τ置标尺为吸光度“”

调0%τ

置入样品

置入样品

读出数据读出数据

用标准曲线法对物质定量

取已知含量的标准样品

按样品各自的分析规定制备样品溶液及背景溶液

设波长，置空白，条；调零，置“吸光度”，读出样品吸光度

重复上述读出各标准溶液的吸光度

绘制已知含量及读得吸光度绘制坐标图并画出最佳曲线

读未知样