金丝猴肠道微生物组数据获取技术规程.docxVIP

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DB53/TXXXX—2021

滇金丝猴肠道微生物组数据获取技术规程

1范围

本文件规定了滇金丝猴（Rhinopithecusbieti）肠道微生物组数据获取的基本要求、样品采集和保存、肠道微生物总DNA提取及检测、肠道微生物组高通量测序、肠道微生物组数据获取。

本文件适用于野外及圈养滇金丝猴微生物组数据获取。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

肠道微生物gutmicrobiota

动物肠道中存在的数量庞大的微生物，并帮助宿主完成多种生理生化功能的微生物群落。

3.2

肠道微生物总DNAgutmicrobiotatotalDNA

肠道内所有微生物DNA和部分宿主DNA的总和。

3.3

宏基因组metagenome

特定环境下所有生物的遗传物质的总和，其中包括了样品中所有微生物的遗传信息。3.4

16S核糖体RNA（16SrRNA）

细菌染色体上编码核糖体RNA亚基的一个基因，存在于所有细菌的基因组中。3.5

16S核糖体RNAV3-V4区（16SrRNAV3-V4）

16SrRNA基因序列中高度变化的区域。

3.6

聚合酶链式反应polymerasechainreaction，PCR

以一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸(dNTPs)为原料，在合适的温度、离子条件和耐热DNA聚合酶催化下，在体外人工合成特异的DNA片段的过程。

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3.7

基因组测序genomesequencing

对生物体的基因组序列进行测定，以获得基因组信息。

3.8

高通量测序high-throughputsequencing

能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的技术。

3.9

读长Reads

高通量测序平台产生的序列称为Reads，即测序读到的碱基序列片段，是测序的最小单位。3.10

宿主host

给微生物提供营养和场所的生物，本标准中指滇金丝猴。

4基本要求

4.1实验室通用要求

实验室应满足GB19489中生物安全实验室的要求。

4.2主要试剂及仪器设备

主要试剂及仪器设备见附录A。

5样品采集和保存

肠道微生物从滇金丝猴粪便样品中获取，粪便样品的采集和保存方法见附录B。

6滇金丝猴肠道微生物总DNA提取及检测

6.1试剂盒选取

选取滇金丝猴粪便样品中提取肠道微生物总DNA，有多种商用试剂盒可供选择。

6.2肠道微生物总DNA提取

参照商用试剂盒说明书进行总DNA提取，提取步骤见附录C。

6.3肠道微生物总DNA质量检测

使用微量分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳进行DNA浓度检测。粪便样品提取的总DNA260/280在1.7～2.1之间，浓度超过2ng/μL，总量超过0.25μg的DNA样品为合格。琼脂糖凝胶电泳检测及成像方法见附录C。

7肠道微生物组高通量测序

7.1肠道微生物16SrRNA基因引物选取及扩增

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16SrRNA基因引物选择V3-V4区的引物338F及806R。扩增区域为16SrRNA基因V3-V4区。引物序列及反应条件见附录D。

7.2肠道微生物16SrRNAPCR扩增产物电泳检测及纯化

7.2.1PCR扩增完成后，取PCR产物3μL，经2%琼脂糖凝胶电泳检测，如电泳条带清楚、片段大小正确，表明PCR扩增成功。不符合质量要求的产物，可重新进行PCR扩增。每个样本进行3个PCR重复，需将3个重复的PCR产物混合，以达到测序量。

7.2.2PCR产物纯化，流程参照商用试剂盒纯化流程。纯化步骤见附录D。

7.3肠道微生物16SrRNA基因测序

16SrRNA基因测序使用高通量测序平台进行。根据所使用的建库试剂盒构建文库。根据高通量测序试剂盒和测序仪操作说明完成试剂装载，设置测序参数进行测序。

7.4肠道微生物宏基因组测序

宏基因组测序可使用高通量测序平台进行。根据所使用的建库试剂盒构建文库。根据高通量测序试剂盒和测序仪操作说明完成试剂装载，设置测序参数进行测序。

8肠道微生物组数据获取

8.116SrRNA基因数据质控

16SrRNA基因测序数据，通过生物信息学软件进行质控，获取16SrRNA基因数据。质控去除双端 引物