玉米黄素的测定.docxVIP

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粮油检验玉米黄素的测定

1范围

本文件描述了高效液相色谱法测定玉米及其制品、玉米油中玉米黄素含量的原理、试剂、仪器、试样制备、分析步骤、结果表示和精密度等。

本文件适用于玉米及其制品、玉米油中玉米黄素的测定。

本文件方法的检出限为0.003mg/kg，定量限为0.011mg/kg。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3原理

样品经氢氧化钾溶液皂化使玉米黄素游离后，溶解在甲醇中，用高效液相色谱分离，在波长448nm条件下采用紫外检测器测定玉米黄素含量，外标法定量。

4试剂

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。

4.1甲醇：色谱纯；

4.2乙腈：色谱纯；

4.3甲基叔丁基醚：色谱纯；

4.4正己烷：色谱纯；

4.5抗坏血酸；

4.6氢氧化钾；

4.7无水硫酸钠；

4.8无水乙醇：优级纯；

4.9标准品

玉米黄素（C40H56O2，CAS号：144-68-3），纯度不低于95.0%。

4.10氢氧化钾溶液：称固体氢氧化钾（4.6）500g，加入500mL水溶解。临用前配制。

4.11玉米黄素标准储备溶液（20μg/mL）：称取1.0mg玉米黄素标准品（4.9）置于50mL棕色容量瓶中，用甲醇（4.1）溶解并定容，摇匀备用。该标准储备液充氮避光置于-20℃或以下的冰箱中可保存6个月。

4.12玉米黄素标准工作溶液：分别移取0.025mL、0.15mL、0.3mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL玉米黄素标准储备溶液（4.11）于10mL容量瓶中，并用甲醇（4.1）定容，摇匀备用。标准工作液充氮避光置于-20℃或以下的冰箱中可保存30天。

5仪器

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5.1高效液相色谱仪：配紫外检测器。

5.2高效液相色谱柱：C30柱（250mm×4.6mm，5μm），或等效柱。

5.3分析天平：感量0.0001g。

5.4恒温振荡水浴箱：控温精度±2℃。

5.5旋转蒸发器。

5.6氮吹仪。

6分析步骤

注：由于玉米黄素对光敏感，除非另行说明，所有试验操作应在无500nm以下紫外光的黄色光源或红色光源环境中进行。

6.1试样制备

将一定数量的样品按要求经过粉碎、均质、缩分后，储存于样品瓶中。制备好的试样应充氮密封后置于-20℃或以下的冰箱中保存。

6.2测试溶液的制备

6.2.1预处理

称取2.0g（精确至0.0001g）样品，转至250mL锥形瓶中，加入1g抗坏血酸、75mL无水乙醇，避光于60℃±1℃水浴振荡30min。

6.2.2皂化

加入25mL氢氧化钾溶液，盖上瓶塞。置于已预热至53℃±2℃恒温振荡水浴箱中，避光皂化45min。皂化后立即冷却到室温。

6.2.3试样萃取

将皂化液转入500mL分液漏斗中，加入100mL正己烷，轻轻摇动，排气，盖好瓶塞，室温下振荡10min后静置分层，将水相转入另一分液漏斗中按上述方法进行第二次提取。合并有机相，用水洗至近中性。弃水相，有机相通过无水硫酸钠过滤脱水。滤液收入500mL蒸发瓶中，于旋转蒸发器上40℃±2℃减压浓缩，近干。用氮气吹干，加入1.0mL甲醇，盖上瓶塞，充分溶解提取物。经0.45μm膜过滤后，弃出初始约1mL滤液后收集至进样瓶中，供液相色谱测定。

6.3仪器参考条件

6.3.1色谱柱：C30色谱柱，5μm，250mm×4.6mm(内径)或相当者；

6.3.2柱温：30℃;

6.3.3流动相：甲醇-乙腈=40+60，B甲基叔丁基醚；梯度洗脱程序参考表1。表1流动相梯度洗脱程序

时间

A

B

0

100

0

2

100

0

18

50

50

20

100

0

21

100

0

6.3.4流速：1.0mL/min;

6.3.5检测波长：448nm;

6.3.6进样量：10μL。

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6.4标准曲线的制作

将标准系列工作液分别注入液相色谱中，测定相应的峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

6.5试样溶液的测定

待测样液中玉米黄素的响应值应在仪器线性响应范围内，否则应适当稀释或浓缩。标准工作液与待测样液等体积进样。根据标准