trap提端粒酶的原理.pdf

基本原理

利用端粒酶在体外可以以其自身RNA的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添

加6个碱基的重复序列的特性，采用PCR方法扩增此重复序列，并进而用聚丙烯酰胺(PAGE)

凝胶电泳显示6个碱基差异的梯带。1994年Kim建立的TRAP法，其主要原理如下：首

先合成一个18nt的TS做上游引物，端粒酶结合TS末端的GTT并合成AGGGTTAG，然

后每经过一次转位合成一个ggttag的6碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入CX做下游引

物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。

我公司提供的PCR端粒酶活性检测试剂盒基于同样的的原理，利用银染技术检测端粒

酶的活性。阳性结果在凝胶电泳上显示相隔6bp的梯状条带，条带的多、寡、深或浅表示端

粒酶活性的大小。TRAP-银染法保留了传统TRAP法灵敏度高、特异性强等优点，避免了

同位素的放射污染。同时，还增设了内标准物，提供阳性对照品，优化了引物设计，使PCR

效果进一步提高，使之能够高灵敏的检测到细胞和组织提取物中端粒酶的活性。

基本原理

利用端粒酶在体外可以以其自身RNA的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添

加6个碱基的重复序列的特性，采用PCR方法扩增此重复序列，并进而用聚丙烯酰胺(PAGE)

凝胶电泳显示6个碱基差异的梯带。1994年Kim建立的TRAP法，其主要原理如下：首

先合成一个18nt的TS做上游引物，端粒酶结合TS末端的GTT并合成AGGGTTAG，然

后每经过一次转位合成一个ggttag的6碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入CX做下游引

物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。

我公司提供的PCR端粒酶活性检测试剂盒基于同样的的原理，利用银染技术检测端粒

酶的活性。阳性结果在凝胶电泳上显示相隔6bp的梯状条带，条带的多、寡、深或浅表示端

粒酶活性的大小。TRAP-银染法保留了传统TRAP法灵敏度高、特异性强等优点，避免了

同位素的放射污染。同时，还增设了内标准物，提供阳性对照品，优化了引物设计，使PCR

效果进一步提高，使之能够高灵敏的检测到细胞和组织提取物中端粒酶的活性。

TRAP-银染法端粒酶活性检测试剂实验方法

试剂盒组份

组分50次实验量

Washbuffer11ml

Lysisbuffer2.2ml

10×PCRbuffer140μl

dNTPs165μl

Primer1165μl

Primer228μl

Primer3110μl

Taq-DNAPolymerase17μl

ddH2O750μl

阳性对照模板55μl

内标准模板55μl

操作步骤

1、端粒酶的提取

⑴手术后取下的活组织，立即保存在液氮之中。

⑵40～100mg冷冻(-70%℃)组织用无菌眼科手术剪尽量剪碎，研磨器研磨，加入40ul

Lysisbuffer(使用前每mlLysisbuffer加入2μlβ-巯基乙醇);或1～2×106沉淀细胞直接加入

40μl预冷的Lysisbuffer，悬浮细胞，涡旋振荡10s,置冰浴中30min，每间隔数分钟涡旋振荡

一次，共5-6次。

备注：为了获取比较理想的端粒酶提取液，建议在一些干硬组织中适当加入Washbuffer。

⑶4℃离心(13000rpm,20min)。

⑷移取上清，分装3-4管，每管约20μl。其中一份样品用于蛋白质浓度定量，其余迅

速冷冻，-70℃保存。

2、PCR扩增(1×25ul)

Ⅰ液(μl)Ⅱ液(μl)

ddH2O7.55.5