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qPCR技术概述

目录第一部分：RNA提取RNA的重要性RNA提取的方法RNA质量的鉴定第二部分：荧光定量荧光定量的原理和方法荧光定量的应用市场上常见的荧光定量产品2024/11/282

2024/11/283从RNA开始到基因拷贝数的定量或者表达研究，已经成为大多数实验的主流设计方案，也是RNA相关课题研究的首选思路。完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作,如Nothern杂交、RNA芯片，mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。1.RNA提取的重要性

2024/11/2841.RNA提取的重要性

2.RNA提取方法2024/11/285细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂（SDS、胍盐等),迅速破坏细胞结构，抑制RNA酶的活性，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。通过有机溶剂（酚、氯仿等）处理可以使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。

2.RNA提取方法2024/11/286欲提取RNA的样本释放出RNA得到纯化的总RNA对RNA保存异硫氰酸胍，胍盐/β-巯基乙醇等，对细胞进行裂解有机溶剂或硅基质吸附等方法对RNA进行纯化

2.RNA提取方法—样品准备2024/11/287样本最好用新鲜或者速冻(不能未经液氮速冻而直接保存于-70℃冰箱中)的没有经过反复冻融的样本。样品预处理方式：不同来源的样品（如细菌、酵母、血液、动物组织、植物组织、细胞等）因细胞结果不同预处理方式亦有所不同。一般处理方式如下：植物材料—液氮研磨动物材料—匀浆(液氮条件下)、液氮研磨细菌—溶菌酶破壁

2.RNA提取方法—细胞裂解异硫氰酸胍/苯酚法（TRIzol法）:TRIzol方法，Invitrogen公司最先开发，应用于大部分动植物材料，但对次生代谢较多的植物材料，RNA提取效果较差。异硫氰酸胍能使核蛋白复合体解离，并将RNA释放到溶液中。而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。2024/11/288基因组DNA水相有机相RNA

2.RNA提取方法—细胞裂解胍盐/β-巯基乙醇法：Qiagen公司最先开发,此方法适用于各种不同动物材料和次生代谢物少的植物材料。胍盐使细胞充分裂解，β-巯基乙醇作为蛋白的变性剂在实验全程可以抑制RNase的活性，保护RNA不被降解2024/11/289

2.RNA提取方法—细胞裂解2024/11/2810其他方法：有些植物材料多糖多酚，如植物果实，番茄叶子等；有些植物木质化程度较高，如根茎等组织，这些都会导致RNA提取过程的困难。如：纤维组织（心脏，骨骼肌等）由于这些组织细胞密度低，单位重量组织中RNA含量低，所以需要增加起始量。蛋白/脂肪含量高的组织（脑，油菜，菜籽等）如果抽提后上清含白色絮状物，需要重新抽提。

2.RNA提取方法—纯化2024/11/2811纯化原则：消除RNA样品中存在的对酶（如逆转录酶）有抑制效应的有机溶剂和高亮度的金属离子。避免其它生物大分子如蛋白质、多糖、脂类分子的污染。排除DNA分子的污染

2.RNA提取方法—纯化有机溶剂抽提法抽提：常用氯仿，以去除蔗糖、蛋白等杂质沉淀：用异丙醇或乙醇来沉淀水相中的RNA洗涤：75%的乙醇洗涤，去除盐离子溶解：加入适量的RNase-freeddH2O2024/11/2812

2.RNA提取原理—纯化硅基质吸附法利用核酸与硅基质材在高盐条件下结合，低盐条件下脱离的特征。2024/11/2813

3.RNA评价与鉴定提取RNA后我们需要对RNA进行相关的质量检测，以确定它是否符合后续试验的要求。RNA用于不同的后续试验，对其质量要求不尽相同。如：cDNA文库构建：要求RNA完整，且无酶抑制物残留Northernblot：对RNA的完整性要求高RT-PCR:对酶反应抑制物残留要求严格2024/11/2814

3.RNA评价与鉴定RNA纯度检测—分光光度计法通过OD260/280来检测RNA的纯度，OD260/230作为参考OD260/280在1.9-2.1之间，可以认为RNA的纯度较好；OD260/280小于1.8，则表明蛋白质杂质较多；OD260/280大于2.2，则表明RNA已经降解；OD260/230小于2.0，表明裂解液中有异硫氰酸胍和β-疏基乙醇的残留。2024/11/2815

3.RNA评价与鉴定rRNA占总RNA的80%-85%，在琼脂糖凝胶上可以清晰的看到28S(23S)和18S（16S）rRNA。当28Sr