第11章--临床免疫学检验仪器与技术.ppt

施新明一、酶联免疫吸附试验（二）酶联免疫吸附试验技术常用酶与底物常用酶作用底物显色辣根过氧化物酶，HRP邻苯二胺，OPD四甲基联苯胺TMB黄色蓝色碱性磷酸酶，ALP对-硝基苯磷酸酯PNP黄色β-半乳糖苷酶，β-Gal4-甲伞酮基-β-D-半乳糖苷葡萄糖氧化酶，GOD对硝基氮蓝四唑蓝色二、酶标仪（一）酶标仪的基本原理与结构基本工作原理和主要结构与光电比色计基本相同。相当于专用于ELISA的光电比色计或分光光度计。二、酶标仪（二）酶标仪的性能要求酶标仪计量性能评价要求包括：外观检查、示值稳定性、波长示值误差、波长重复性、吸光度示值误差、吸光度重复性、灵敏度、通道差异、绝缘电阻9项。与检测性能相关的有7项。示值稳定性要求在±0.005；波长示值误差±3nm；波长重复性±1.5nm；吸光度示值误差±0.03；吸光度重复性1%；灵敏度≥0.01L/mg；通道差异0.03。三、全自动酶免疫分析系统（一）全自动酶免疫分析系统的基本结构全自动酶免疫分析系统是具有自动加样本、加试剂，自动控温温育，自动洗板和自动判读计算等功能的分析系统。可用于各种酶免疫实验、血库筛查、生化检测、细胞培养、分子生物学等各个方面。三、全自动酶免疫分析系统（二）全自动酶免疫分析系统的特点1．加样系统加样系统用于样本和试剂的分配加样系统永久性加样针采用一次性吸头三、全自动酶免疫分析系统（二）全自动酶免疫分析系统的特点2．温控孵育系统提供在孵育时酶标板所需温度，防止蒸发，并可振荡孵育，可使免疫反应更加充分，提高检测灵敏度。3．洗涤工作站洗涤工作站主要用于洗涤加样针和反应板。4．酶标仪洗板机酶标仪第四节化学发光免疫分析仪器与技术一、化学发光免疫分析技术原理与分类（一）化学发光免疫分析技术原理化学发光的原理在化学反应过程中，发光剂吸收化学能后，从稳定的基态分子被激发到不稳定的激发态，在激发态时分子有很高并且不稳定的能量，释放能量重新回到基态，能量以光子形式释放。一、化学发光免疫分析技术原理与分类（一）化学发光免疫分析技术原理2.化学发光免疫分析的原理通过免疫反应特异性地将待测组分从样本中分离，再通过化学发光反应显示分离的组分，并且化学发光的反应强度与待测组分的含量成一定的比例关系。一、化学发光免疫分析技术原理与分类（二）化学发光免疫分析技术的分类化学发光酶免疫测定将酶标记于示踪抗体上，再以酶催化底物进行化学发光反应。常用的工具酶有：辣根过氧化物酶（HRP）常用的底物有鲁米诺或其衍生物异鲁米诺，在HRP和启动发光试剂（NaOH和H2O2）作用下进行发光反应，其波长为425nm。是一类重要的发光试剂。碱性磷酸酶（ALP），常用的底物是AMPPD，ALP水解AMPPD，产生金刚烷酮和产生470nm的光，可持续几十分钟。一、化学发光免疫分析技术原理与分类（二）化学发光免疫分析技术的分类2.化学发光免疫测定用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物，通过启动发光试剂（NaOH和H2O2）作用而发光，强烈的直接发光在一秒内完成，为快速的闪烁发光。特点：化学反应简单、快速、无需催化剂；检测小分子抗原时一般采用竞争法，大分子抗原则大多采用夹心法。非特异性结合少、本底低；检测大分子灵敏度高。一、化学发光免疫分析技术原理与分类（二）化学发光免疫分析技术的分类3.电化学发光免疫测定反应体系中含有三联吡啶钌[Ru（bpy）3]2+，再加入含三丙胺（TPA）的缓冲液，电极加电压，使二价钌被氧化成三价，TPA被氧化形成强还原剂，形成激发态的钌，激发态的三联吡啶钌不稳定，发射出一个波长620nm的光子，重新生成基态的钌，发光标记物可循环发光。一、化学发光免疫分析技术原理与分类（二）化学发光免疫分析技术的分类4.光激化学发光免疫分析技术竞争法光激化学发光原理抗体包被感光微球，抗原包被发光微球，抗体与抗原结合，感光微球在680nm激发光照射下，产生单线态氧扩散至发光微球并传递能量，发光微球发射520～620nm荧光信号。单线态氧的半衰期只有4微秒（μs），在反应体系中只能扩散大约200nm。发光的量与样品中的待测抗原量成反比。一、化学发光免疫分析技术原理与分类（三）顺磁性颗粒分离技术顺磁颗粒的核心为氧化铁，表面包有高分子化合物。特点：顺磁性：指有些固体的原子具有本征磁矩。当受外磁场作用时，表现出宏观磁性。没有外加磁场时，颗粒间没有相互作用，能够在液体中形成均匀的悬液。大比表面积：表面功能基团密度及选择性吸附能力变大，生物相容性：