DB32T 2571-2013 鸡传染性支气管炎RT-LAMP 诊断技术规程.docxVIP

ICS65.020.99B22

备案号：40457-2014

DB32

江苏省地方标准DB32/T2571-2013

鸡传染性支气管炎RT-LAMP诊断技术规程TechnicalcodeofdetectingRT-LAMPforInfectiousBronchitis

2013-12-20发布2014-01-20实施

江苏省质量技术监督局发布

DB32/T2571-2013

前言

为规范鸡传染性支气管炎RT-LAMP诊断技术规程，提高鸡传染性支气管炎病毒检测的灵敏度、稳定性、特异性，特制定本标准。

本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》要求编写。本标准的附录为规范性附录。

本标准由江苏省农业科学院提出。

本标准起草单位：江苏省农业科学院。

本标准起草人：刘宇卓、李银、黄欣梅、赵冬敏、韩凯凯、张敬峰。

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DB32/T2571-2013

鸡传染性支气管RT-LAMP诊断技术规程

1范围

本标准规范了鸡传染性支气管炎RT-LAMP诊断技术所用引物大小、所涉及的样品范围、操作流程、反应条件等技术标准。

本标准适用于鸡传染性支气管炎的实验室诊断、临床诊断、流行病学调查、分离毒株的鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB16548-2006病害动物和病害动物产品生物安全处理规程

GB/T23197-2008鸡传染性支气管炎诊断技术NY/T541-2002动物疫病实验室检验采样方法

3主要试剂和仪器

3.1DNAMarkerDL-2000

3.26xLoadingbuffer

3.3BstDNAPolymerase

3.4MgSO4

3.5DEPC

3.6Betaine

3.7lOXThermoPolbuffer

3.8异丙醇

3.9无水乙醇

3.10琼脂糖

3.11核酸染料

3.12氯仿

3.13电泳仪

3.14电热恒温水槽

4引物

按照GenBank上公布的鸡传染性支气管病毒（IBV）衣壳蛋白M基因序列保守区域，应用在线LAMPprimerdesigningsoftwarePrimerExplorer设计一套引物，序列如下：

F3：5′一AAGGATTTGGCCCTCGTA一3′；

FIP：5′一TGTAACACGCCCATCATAATTCCTAAGAAGGGAAATTTTGGTGAT一3′；

BIP：5′一CTCATGCTTGTCTTTTTGGAAGTAGCAGTAGTAAATTCAAATCTAAGGTG一3′；B3：5′一CTGCGGGTCATCTCTAGG一3′。

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DB32/T2571-2013

ddH20溶解成25Pmo1/ul后分装，一20℃冰箱保存备用。

5临床诊断

按照GB/T23197-2008鸡传染性支气管炎诊断技术方法进行临床诊断。

6采样和样品的处理

6.1病料的采集及处理

按照NY/T541-2002动物疫病实验室检验采样方法，采集病料后，于0～4℃冷藏保存并立即送检，采样过程中样品不得交叉污。

6.1.1对于急性呼吸道的病鸡，采集分泌物，对于刚扑杀的鸡，则采取支气管和肺组织。

6.1.2对于肾型和产蛋下降型的病鸡，应采取发病鸡的肾脏及输卵管。

6.2样品的处理

取无菌采集支气管、肺或者是肾脏、输卵管等组织，置研钵中剪碎并研磨，反复冻融三次，将研磨好的组织以4℃12000rpm/min离心10min，取上清200μL备用。或者经过鸡胚接种后的尿囊液200μL备用。

7RT-LAMP

7.1RNA的提取

取已处理的待检样品，以IBV阳性病毒为阳性对照，以无菌水为阴性对照，每管依次加入Trizol600μL，振荡混匀后，室温放置10min，加入氯仿200μL，剧烈振荡后，室温放置1min，4℃12000rpm，离心15min，取上层水相750μL，加入500μL异丙醇，混匀，-20℃放置15min，4℃10000rpm离心10min，去上清，缓缓加入75%乙醇1mL洗涤，4℃8000rpm离心5min，去上清，室温干燥20min，加入DEPC水10μL，使