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分子生物学技术在新型脱氮工艺微生物学研究中的应用与进展1

郭劲松，秦宇，方芳，杨国红

重庆大学三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆（400045）

摘要：分子生物学技术作为一门现代生物学，弥补了常规微生物学试验的不足，能对环境样品中的微生物进行原位观察，有效、快速、准确地反映环境样品中的微生物信息。回顾分子生物学技术在SHARON、ANAMMOX、CANON以及OLAND等新型脱氮工艺中微生物学研究方面的应用与进展，该技术为其机理探讨提供了可靠的科学依据，作出了重大贡献。同时介绍了应用于环境领域中最常用的几种分子生物学技术，并对其在该领域的发展进行了展望。

关键词：分子生物学，微生物，新型脱氮工艺

1.引言

水体氮污染威胁到我们赖以生存的生态环境，开发经济有效的生物脱氮技术已成为国内外的研究热点，其中新型脱氮工艺，如SHARON、ANAMMOX、CANON、OLAND等，以其高效节能的特点近年来更是受到学者的广泛关注。由于这类工艺在反应原理上与传统脱氮工艺有本质上区别，其机理研究日益成为研究重点。

新型脱氮工艺反应器内微生物学研究是其机理研究的一个重要组成部分。传统微生物学实验虽能在一定程度上检测出新型脱氮工艺中某类已知细菌的总数、通过功能判断以及外表观测确定功能菌种等，但对于微生物多样性及其在环境领域作用的了解仅靠传统的微生物学方法如显微镜、菌种培养等是不够的，这主要是由于微生物形态简单，缺乏明显的外部特征；而且由于难以模拟大多数自然环境中微生物生长繁殖的真实条件而不能获得微生物的纯培养[1]；此外，一些细菌的世代周期很长，比如ANAMMOX工艺中的厌氧氨氧化菌，其世代周期在11d以上，很难采用培养的方法进行分离[2]。再加上如选择性培养基计数等定量方法的不准确性，使得现今对于处理工艺中微生物与处理效果相关性的研究仍处于“黑箱”阶段。此外，由于新型脱氮工艺关于其机理研究尚处于初级阶段，到底有哪些微生物参与了反应尚不明确，这也使得采用常规微生物学手段有一定的困难。因此，为了更好地研究新型脱氮工艺的反应机理、为其控制反应条件提供理论依据、为实际应用奠定理论基础，迫切需要其他的生物学新技术。

近年来，越来越多的研究者开始运用分子生物学技术对新型脱氮工艺中的微生物进行分析[3~5]。分子生物学技术使得研究者们能够在遗传水平上研究微生物的多样性，不仅节省传统细菌培养所需时间，提高检测的灵敏度，而且能对环境样品中的微生物进行原位观察，充分反映样品原有微生物组成，有效、快速地得到环境样品的微生物信息，它在医学[6]、食品[7]等领域已得到广泛应用。随着人们对新型脱氮工艺的关注，分子生物学技术的应用在该领域也取得了重要进展。

1本课题得到国家自然科学基金资助项目、高等学校博士学科点专项科研基金项目

（20050611010）、重庆市自然科学基金项目（CSTC2005BB7266）、重庆大学骨干教师资助项目资助。

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2.分子生物学技术概述

分子生物学（MolecularBiology）是一门现代生物学，是在生物化学与遗传学、微生物学、细胞学、生物物理学等学科相结合的基础上发展起来的崭新学科[8]。它将研究对象主要集中于生物大分子——核酸（DNA和RNA）。分子生物学正对生物科学各个领域进行广泛渗透和影响，成为带动整个生命科学的前沿学科，并已成为现代生命科学的“共同语言”[8]。目前，已开发并应用于环境领域。研究微生物群落的分子生物学技术主要有以下几种：

2.1荧光原位杂交

荧光原位杂交技术（fluorescentinsituhybridazation，FISH）问世于20世纪70年代后期，是根据已知微生物不同分类级别上种群特异的DNA序列，以利用荧光标记的特异寡核苷酸片段作为探针，与环境基因组中DNA分子杂交，检测该特异微生物种群的存在与丰度[9]。该方法的特点是可以进行样品的原位杂交，以避免细菌的培养，清楚并方便地观察到样品中细菌的细胞数量和空间位置，而且可以通过不同的寡核苷酸探针同时对不同类群的细菌在细胞水平上进行原位的定性定量分析和空间位置识别。早在十几年前，FISH就开始被用于微生物的检测，并成为了微生物学的一个突破[10]，近年来应用于环境中特定微生物种群的鉴定、种群数量分析及其特异微生物跟踪检测。采用该技术已发现了许多新的微生物物种。

2.2多聚酶链式反应

多聚酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）是由美国Cetus公司Mullis等人[11]在1985年建立起来的一套大量快速扩增特异DNA片段