《医学免疫学》免疫标记技术.pptx

免疫标记技术;目的要求;免疫标记技术=;优点：特异、敏感、精确、快速、可定性、定量甚至定位，操作简便，易于商品化和自动化。

常用标记物：

荧光素（异硫氰酸荧光素、罗丹明）

酶（辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）

放射性同位素（125I）

生物素、铁蛋白、胶体金、化学发光物质;一、免疫酶测定法（enzymeimmunoassayEIA);常用的酶的底物

（1）辣根过氧化物酶（HRP）常用底物：

邻苯二胺（OPD）：反应显橙黄色，应避光，致癌性。

四甲基联苯胺（TMB）：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差。

（2）碱性磷酸酶（AP）

对硝基苯磷酸酯（p-NPP），产物为黄色。;酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassayELISA）：检测可溶性抗原，可定性、定量，不能定位

酶免疫组化（IHC）：检测组织和细胞中的抗原，可定性、定位，不能定量

;(一)酶联免疫吸附试验

（Enzyme-linkedImmunosorbentAssay，ELISA);原理

使Ag或Ab结合到某种固相载体表面，保持其免疫活性。

用酶标记Ag或Ab，同时保留免疫活性和酶活性。

将受检标本和酶标物质按不同步骤与固相载体表面物质反应，洗涤游离物质。

酶将底物催化，显色深浅与受检Ag或Ab的量成正比。

借助颜色反应的深浅来定性、定量Ag或Ab。;比色

比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。用特定的波长测读吸光值。

比色结果的表达以往通用光密度(opticaldensity,OD),现按规定用吸光度(absorbence,A),两者含义相同。

通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为490nm，表示方法为A490nm或OD490nm。;EquipmentforperformingtheELISAtest;特点

敏感性高、特异性强、操作简单、结果易观察

常用方法：

1.双抗体夹心法：最常用来检测抗原

2.间接法：最常用来检测抗体

3.BAS-ELISA:提高实验敏感性;1)双抗体夹心法;2)间接ELISA;3)BAS-ELISA(biotin-avidinsystem,BAS-ELISA);;BAS的优点：BAS-ELISA比标准ELISA的敏感性大大提高。

BAS的缺点：亲和素是PI较高的糖蛋白，对聚苯乙烯、硝酸纤维素膜、DNA有较高的非特异吸附，在ELISA、免疫组化、DNA杂交等检测中应用出??较高的背景着色。;5）斑点ELISA(dot-ELISA);（二）免疫组化技术;间接SABC-AP法

T细胞亚群检测;小鼠肝癌石蜡切片免疫组化;二、免疫荧光技术;荧光抗体是将荧光素（如FITC）与特异性抗体以化学方式共价结合而成。

常用于标记的荧光素：

异硫氰酸荧光黄（FITC）--黄绿色荧光

四乙基罗丹明（RB200）--明亮橙色荧光

四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）--橙红色荧光。

标记方法：搅拌法(适合大样品)

透析法(适合小样品)

标记抗体的纯化：透析法、层析分离法;免疫荧光技术类型;2.间接法;三、放射免疫测定;放射免疫测定;四、发光免疫分析(luminescenceimmunoassay,LIA);发光;根据发光免疫技术中发光标记物不同，分为四种类型。

化学发光免疫分析(chemiluminescenceimmuneassay，CLIA)

生物发光免疫测定(bioluminescenceimmunoassay,BLIA)

化学发光酶免疫分析(luminescenceenzymeimmunoassay，IEIA)

电化学发光免疫分析(electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA）;1)化学发光免疫测定（CLIA）;2)生物发光免疫测定（BLIA）;3)化学发光酶免疫分析;4)电化学发光免疫分析(ECLIA);五、免疫胶体金技术（ICS）;胶体金标记技术的类型;胶体金标记技术的类型;（二）斑点免疫层析试验;;原理;亦被称为westernblotting，免疫印迹法是将电泳与ELISA结合起来的一种方法

分三个阶段进行

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）

电转移

酶免疫定位

免疫印迹法结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，是一种能用于分析样品组分的免疫学测定方法。;PartII蛋白质芯片技术;用途;特点;优点;面临挑战;小结;thankyou