《医学免疫学》第25章免疫细胞的分离与功能测定.pptx

第25章免疫细胞的分离

与功能测定;根据各类免疫细胞独特的表面标志及其特殊功能。用体外或体内方法将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来，对其进行数量和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段,免疫学中进行细胞分离、培养和建立细胞株等研究的重要基本技术之一。;第一节免疫细胞的分离;;方法;红细胞：1.093

粒细胞：1.092

淋巴细胞和单核细胞的密度：1.075-1.090

BPC为1.030-1.035;用1.077±0.001的分层液可将PBMC细胞分离;稀释的血液

分层液;PBMC悬液主要含淋巴细胞，但一般还混杂有数量不等的单核细胞及少量粒细胞、红细胞和血小板。

为获得高纯度的淋巴细胞或其亚群，可采用如下分离去除方法。;1.去除RBC：一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理。

2.去除单核细胞和粒细胞：

1）粘附法：单核细胞和多形核白细胞具有粘附能力，与玻璃或塑料平皿的粘附作用，采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。

评价：优点简便易行对细胞损伤极少；缺点B细胞也有一定的粘附能力，此法有所损失。;3.淋巴细胞的分离：

（1）E花环分离法：T细胞的CD2结合SRBC，形成E花环，而B细胞不能。经聚蔗糖泛影葡胺密度梯度离心，E花环沉积于管底，用低渗法裂解SRBC，可获得纯化的T。

优点：简便易行，可大量分离T细胞，纯度较高（95-99%），可同时获得B细胞。

缺点：E花环形成后可使T细胞活化。

;（2）尼龙棉柱分离法：

原理：B易于粘附尼龙棉纤维，而T不易粘附。

方法：淋巴细胞→通过聚酰胺纤维管→洗脱下来的是T细胞

优点：简便快速，无需特殊设备，淋巴细胞活性不受影响，纯度可达90%以上。

缺点：尼龙棉柱可能滞留某些T细胞亚群。

;（3）免疫吸附分离法：特异性抗体包被塑料平皿或细胞培养板，表达特定表面抗原的细胞与相应抗体结合被吸附于平皿，可与悬液中其他细胞分开。

优点：可同时进行阳性和阴性细胞分离，所获细胞量较大。

缺点：所获吸附细胞时易损伤细胞，另外吸附时易导致细胞的活化。一般用于阴性细胞分离。;（4）免疫磁珠法（immunemageticbeadIMB）：首先将特异性抗体吸附到磁性微球上，加入细胞悬液中，具有特异性表面标??的细胞与磁珠上的特异性抗体结合。;FCM是一项综合众多不同学科的先进技术，集光学、流体力学、电力学和计算机技术于一体，可对细胞进行多参数定量测定和综合分析的方法。

既可以做细胞检测也可以做细胞分选;现在生产流式细胞仪的主要厂家是美国BD和Coulter两家公司。

单克隆抗体技术的引进，为细胞研究中大量特异性免疫试剂的应用奠定了基础，科学家们、仪器制造商们纷纷将研究焦点转向荧光染料的开发、细胞的制备方法以及提高电子信号的处理能力上来。;主要由4部分组成:

细胞流动系统及气压流速控制系统;

激发系统;

检测与讯号处理系统;

细胞分选系统。

其原理是：将待测细胞悬液与荧光素标记的抗体反应后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区进行测定。当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴(4000个/s)，每小滴内最多含一个细胞，细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞的类型.;荧光激活细胞分离仪分离法;抗原肽-MHC分子四聚体技术分析CTL;第二节淋巴细胞的保存和活力测定;（2）长期保存及复苏;冷冻方法：

1.传统方法:4℃10分钟---20℃30分钟----80℃16-18小时(或隔夜)---液氮长期储存。

2.程序降温：利用等速降温机以–1～-3℃/分钟之速度由室温降至–120℃，放在液氮长期储存。;2、细胞活力的检测

常用方法是台盼蓝染色法。这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，死亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细胞而使细胞着色（蓝色）。;淋巴细胞功能测定:

体内实验主要是进行迟发型超敏反应，借此了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应。

体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定。

淋巴细胞功能测定是免疫缺陷病诊断的主要依据，也是探讨淋巴细胞在参与机体多种疾病的发病机理、疗效判断、免疫治疗及预后的重要依据。

;（一）T细胞功能测定;其主要实验过程是将外周血液或分离的单个核细胞与适量PHA或其他刺激物混合，置37℃培养72h，取培养细胞作涂片染色镜检。PHA可与T细胞膜上的受体结合，使腺苷酸环化酶活化，导致cAMP增多，从而使T细胞发生转化，出现细胞变大，胞浆扩大，空泡、核仁明显和核染色质疏松等变化。

根据细胞的大小，核与胞